Ebben a tanulmányban azt feltételeztük, hogy az RNS izolálás különböző módszerei befolyásolják az eredményeket a szövetekben történő génexpresszió elemzésénél. Az RNS extrakciós módszerek nagyjából a következőkre jellemezhetők: fenol:kloroform extrakció, majd alkoholos kicsapás (TRIzol), fenol:kloroform, majd szilárd fázisú extrakció (oszlopalapú; miRVana és miRNeasy) és szilárd fázisú elválasztás affinitásgyantával/ anélkül (Norgen total és Isolate II). Ezeket a módszereket elsősorban hosszú mRNS-ek extrakciójára fejlesztették ki, és azon a feltételezésen alapulnak, hogy minden RNS-t egyformán tisztítanak. Ezenkívül számos szempontot figyelembe kell venni egy adott RNS extrakciós módszer kiválasztásakor, például a minőséget, a mennyiséget, az árat és a könnyű alkalmazhatóságot (az extrakcióhoz szükséges idő). A következőkben olyan adatokat mutatunk be, amelyek azt mutatják, hogy az RNS kivonására használt módszer a különböző módszerekhez képest a downstream alkalmazásokban is változó eredményeket fog produkálni, és ezért egy másik fontos szempont.
Ez a tanulmány azt mutatja, hogy az RNS izolálási módszerek eltérnek az RNS minták mennyisége és minősége, valamint a miRNS és a célgének expressziójának elemzése szempontjából. Olyan szerveket választottunk, amelyekből különböző okokból nehéz lehet RNS-t izolálni. Például az agyból történő RNS-izolálásról gyakran megjegyzik, hogy a magas lipidtartalom miatt alacsony hozamot eredményez. Ez különösen a Bioline Isolate II kit esetében volt nyilvánvaló. A gyártó protokollja szerint 10 mg patkány/egér agyból legfeljebb 5 μg RNS-t kell tisztítani. A miRNeasy kézikönyv szerint azonban 5-20 μg RNS nyerhető agyból ugyanolyan mennyiségű bemeneti anyagból. A gyártó weboldalán található hibaelhárítás leírja, hogy a lipidekben gazdag szövetek esetében az egyik probléma az oszlop eltömődése, és javasolja a minta mennyiségének csökkentését vagy a lízispuffer térfogatának növelését. A mi extrakcióinkat a protokoll által javasolt határértékeken belül végeztük. Ezt követően javasolják az előextrakció elvégzését TRIsure reagenssel (a Bioline TRIzol megfelelője), majd oszlop alapú elválasztást a kit segítségével a vizes fázis megtisztítására. Ez a módszer ezután összehasonlítható lenne a miRVana és a miRNeasy RNS extrakciós módszerekkel, és jobb hozamot eredményezhetne ezen szövetek esetében. Ezenkívül az RNS minősége korrelál a szövetspecifikus, fiziológiai stresszre adott szövetspecifikus válaszokkal mind a szövetek elhalását megelőzően, mind azt követően. Az olyan szövetekre, mint a tüdő és a máj, jellemzően alacsony RIN-értékek és kis 28S-csúcs jellemző, mivel ezek a szövetek hajlamosak az RNS gyorsabb lebomlására a nagy mennyiségű nukleázok által. A nukleázok inaktiválása érdekében a szövetet gyorsan lefagyasztják, és a felolvasztást megakadályozzák, amíg a lemért anyagot hozzá nem adják az extrakciós pufferhez. Bár a szövetek felolvasztását megakadályoztuk, nem zárhatjuk ki, hogy az állat elaltatásától és a szervek kivágásától a gyorsfagyasztásig eltelt idő hozzájárulhatott az alacsony RIN-értékekhez és az összes tüdőminta esetében megfigyelt néhány bomlástermékhez, függetlenül az alkalmazott izoláló készlettől. A nukleázok inaktiválásának alternatív módszere az RNS-stabilizáló oldat, például az RNAlater (ThermoFisher Scientific) használata, amely lehetővé teszi a fagyasztás nélküli szövetminták későbbi feldolgozását. Ez segíthet az RNS integritásának biztosításában, de nem kompatibilis minden RNS-izolálási eljárással, és a felhasználóknak az extrakciók elvégzése előtt ellenőrizniük kell az adott módszert. A Bioanalyser-elemzésben egyes mintákban 60 s után megjelenő csúcs hozzáadása gDNS-szennyeződésre utal. Néhány kit esetében az oszlopokon további DNáz-kezelést lehet végezni, azonban a gDNS-eltávolítási lépés a reverz transzkripciós lépés során erősen ajánlott. Ennek a lépésnek a mi módszereinkbe való beépítése magyarázhatja, hogy miért nem volt interferencia a Norgen tüdőminták mRNS-expressziójának elemzésekor, de hatással volt a miRNS-expresszió elemzésére, mivel a Taqman miRNS-vizsgálati protokoll nem tartalmazza a gDNS eltávolítását. Továbbá az RNS-minták tisztasága kritikus tényező, mivel bár a RIN > 7 értékű mintáknak a legtöbb downstream alkalmazásban rendben kell lenniük, az enzimatikus reakciókat, például a qPCR-t magában foglaló mintákat a nukleázok, fémionok vagy szerves szennyeződések gátolhatják. Általánosságban elmondható, hogy a Bioline Isolate II RNS-minták 260/230 aránya alacsonyabb volt, és a szennyeződések hozzájárulhattak a gyenge teljesítményhez. Végül különbségeket figyeltünk meg a miRNS-ek dúsításában a teljes RNS-preparátumban. Mivel a miRNS-ek a teljes RNS-repertoár kis hányadát képviselik, az integritáselemzésből nehéz lehet meghatározni a hozzájárulásukat. A Qubit microRNS-teszt a kis mennyiségű kis RNS-ek rendkívül szelektív kimutatását teszi lehetővé, még a gyakori szennyeződések jelenlétében is. A miRVana és a Norgen extrakciós módszerekkel általában nagy százalékban mutattak ki miRNS-eket, azonban a Norgen teljes RNS-készítmények integritáselemzését figyelembe véve lehetséges, hogy a miRNS-dúsulás túlbecsült lehet, mivel a kisebb RNS-fragmentumok a nagyobb RNS-ek (mRNS-ek, rRNS-ek vagy tRNS-ek) lebomlása vagy oxidációja következtében, vagy a tüdőminták esetében a Qubit eredményeit megzavaró DNS-szennyezés következtében kerülnek kimutatásra. Ezért az RNS-minták mennyisége, minősége és tisztasága rendkívül fontos tényező egy adott RNS extrakciós módszer kiválasztásakor, és a további kutatás arra vonatkozóan, hogy hogyan lehet ezeket a módszereket optimalizálni az adott szövetre, segíthet ezek javításában.
A miRNS-ek profilozása betekintést nyújthat a diagnosztikai vagy prognosztikai alkalmazások biomarkereiként. Például a miRNS-ek paneljei felhasználhatók a különböző rákfenotípusok osztályozására, a kiújulás vagy a terápiákra adott válasz előrejelzésére . A miRNS-alapú biomarkerek felfedezéséhez és klinikai alkalmazásához azonban optimalizált és szabványosított gyakorlatra van szükség az RNS kivonásának módjára vonatkozóan, hogy elkerülhetők legyenek az ellentmondásos eredmények. Zhou és munkatársai (2014) 63 publikált tanulmány metaanalízise például ellentmondásos, sőt ellentétes eredményeket talált az oncomiR, a miR-21 prognosztikai értékének értékelése során. A szerzők a heterogenitást a minták forrásában, a kimutatási módszerekben és a normalizálási módszerekben mutatkozó különbségeknek tulajdonítják, de nem utaltak az RNS kivonásának módszereire, ami, mint mutatjuk, szintén hozzájárul.
Kísérletileg nagyon kevés miRNS biológiai funkcióját és célpontját validálták, pedig ez kritikus fontosságú a miRNS-alapú terápiában rejlő lehetőségek kiaknázásához. Továbbá a szövetspecifikus biológiai funkciók feltárása segíteni fogja a terápiás hatásuk és az esetleges off-target hatások azonosítását a normál szövetekben. A miRNS-mRNS kölcsönhatások validálását elsősorban sejttenyésztési próbákban végzik, amelyek az endogén miRNS-ek mesterséges manipulációjával járnak. A sejtkultúra-manipulációval (pl. mimikumok transzfekciójával) elért szintek azonban általában nem érik el az in vivo megfigyelt fiziológiai szinteket, ezért fontos az eredmények megfelelő állatmodellekben történő reprodukálása. Jelenleg nincs olyan jelentés, amely közvetlenül összehasonlította volna a miRNS és a célgének kimutatását teljes RNS-mintákból különböző extrakciós módszerekkel. Megmutatjuk, hogy az RNS extrakciós módszerek különböznek a rövid és hosszú RNS-ek izolálásának hatékonyságában, ezért alaposan meg kell fontolni a megfelelő módszer kiválasztását, ha ugyanabból a mintából mindkettőt szeretnénk detektálni.
A korábbi kutatások általában azt feltételezték, hogy mindenféle RNS-t egyformán tisztítanak. Azonban több olyan jelentés is megjelent, amely az extrakció hatékonyságának különbségeit jelzi az RNS izolálására használt módszertől függően. Kim és munkatársai (2011) visszavonták a Molecular Cell-ben megjelent tanulmányukat, mivel megállapították, hogy a különböző konfluenciában (nagy sűrűségű versus alacsony sűrűségű) és a tenyésztőedényből leválasztott (adherens versus szuszpenziós) sejtekből származó miRNS-expresszió különbségére vonatkozó következtetéseiket valójában a TRIzol módszerrel végzett RNS extrakció hatékonyságában mutatkozó különbségek magyarázzák . Azt találták, hogy az alacsony GC-tartalmú és stabil másodlagos szerkezetű miRNS-ek elvesznek az extrakció során, ahelyett, hogy lebomlanának a sejtekben, ahogyan azt eredetileg publikálták . El-Khoury és munkatársai (2016) korábbi eredményei a TRIzol LS, a miRNeasy szérum/plazma és a miRCURY biofolyadék extrakciós készletek összehasonlításakor különbségeket találtak a sejtekből, a plazmából és a vizeletből/plazmából származó exoszómákból származó miRNS visszanyerésében . A szerzők azt találták, hogy a miRCURY kit nagy tisztaságú RNS-t izolált, de rosszul nyerte vissza a miRNS-eket, a TRIzol alacsony tisztaságú RNS-t eredményezett, ami befolyásolta a PCR hatékonyságát, míg a miRNeasy rossz minőségű RNS-t eredményezett, de a miRNS kimutatásában a legjobban teljesített. Hasonlóképpen, McAlexander és munkatársai (2013) különbségeket találtak a plazmából és az agy-gerincvelői folyadékból történő miRNS extrakcióban . Összehasonlították a miRVana, a miRCURY Cell and Plant kit és a TRIzol LS extrakciókat glikogénnel, mint hordozóval és anélkül. a miRVana hasonló volt glikogénnel vagy anélkül, míg a miRCURY glikogén nélkül kissé alacsonyabb miRNS visszanyerést mutatott, mint a miRVana. A glikogén azonban jelentősen javította a miRNS visszanyerését a miRCURY kit esetében, de súlyosbította a TRIzol extrakció alacsony hozamát és változékonyságát. Ezután összehasonlították a miRCURY Cell and Plant kitet a miRCURY Biofluids és a miRNeasy szérum/plazma extrakciós módszerekkel glikogénnel mint hordozóval, és megállapították, hogy a miRCURY Biofluids esetében volt a legmagasabb a bepiszkált exogén miRNS relatív bősége, és arra a következtetésre jutottak, hogy ez a módszer a jobb az adott alkalmazásukhoz. Ezek a tanulmányok együttesen rávilágítanak a különböző extrakciós módszerek alkalmazásával történő RNS-kinyerés különbségeire, és azt sugallják, hogy optimalizálni kell az adott sejtre, szövetre és/vagy folyadékra.
A munkafolyamat során számos olyan lépés van, amely kísérleti eltérést eredményezhet. Kezdve a szövet rögzítésének vagy fagyasztásának módszerével, az anyag tárolásával, az RNS extrakciós módszerrel, a reverz transzkripcióhoz és a qPCR amplifikációhoz vagy más downstream platformokhoz használt módszerrel. Ebben a tanulmányban megkíséreltünk néhány ilyen változót kontrollálni a szövetek gyorsfagyasztásával, – 80 °C-on történő tárolásával, az extrakció előtti felolvasztás megakadályozásával és a miRNS-expressziós elemzéshez leginkább ajánlott gyakorlatok alkalmazásával. Például a szekvenciaspecifikus RT-primerek használata az univerzális RT-primerekkel szemben bizonyítottan jobb a specifikus termék amplifikációja szempontjából . A qPCR-t a miRNS- és target-expresszió elemzésének arany standardjának tekintik a globális profilalkotó platformokkal szembeni érzékenysége és specificitása miatt. Fontos, hogy a kapott eredmények minősége fontosabb, mint a nagy szekvenáláson alapuló platformok által profilált miRNS-ek puszta száma. Továbbá, bár nem hasonlítottuk össze az RNS-mintáinkból származó miRNS-dúsítás hatását, a korábbi jelentések ezt ellenezték, különösen a globális miRNS-profilalkotó platformok esetében. Redshaw és munkatársai (2013) például azt találták, hogy a rövid RNS dúsítási eljárás a teljes RNS és a dúsított anyag összehasonlításakor jelentősen kevesebb relatív miRNS-szintet eredményez, konkrétan a dúsítási eljárás a miRNS-ek kópiaszámát akár 25%-kal csökkentette az előzetesen dúsított mintákban jelenlévőhöz képest, és ez a veszteség a különböző miRNS-szekvenciák esetében változott. Ezért a teljes és a rövid RNS-készítményekből származó miRNS-adatok nem feltétlenül hasonlíthatók össze közvetlenül. Továbbá felvetették, hogy a nagyobb RNS hordozóként szolgálhat a kis RNS-ek számára. Azt, hogy a miRNS-ekkel dúsított módszerek minden vállalat számára jobb visszanyerést eredményeznének-e a szövetekből, még meg kell határozni. Bár a Bioline külön kitet javasol a miRNS-izolálásra, mi az Isolate II teljes RNS-kitet használtuk a többi extrakciós módszerrel való közvetlen összehasonlításhoz, mivel a miRNS-specifikus kit nem teszi lehetővé a rövid és hosszú RNS-ek izolálását ugyanabból az elúcióból. Inkább a miRNS-fajokat dúsítjuk és izoláljuk először, majd a hosszú RNS-eket utána lehet kivonni, ami két külön frakciót eredményez. Bár az Isolate II nem a kis RNS-ek izolálására optimalizált, mint a miRVana vagy a miRNeasy kitek, a célgének expressziója szempontjából sem volt jobb. Tekintettel az egyes kitek közötti nagy eltérésre, a kutatóknak egy robusztusabb extrakciós módszert kell választaniuk.