shRNS – Alkalmazások – Mi az a shRNS, hogyan működik és milyen alkalmazásai vannak.

Mi az a shRNS és hogyan használjuk?

A rövid hajtű RNS (shRNS) szekvenciákat általában DNS-vektorban kódolják, amely plazmid transzfekcióval vagy vírusos transzdukcióval juttatható be a sejtekbe. shRNS-molekulák kialakításuk alapján két fő kategóriába sorolhatók: egyszerű stem-loop és mikroRNS-adaptált shRNS. Az egyszerű stem-loop shRNS gyakran RNS polimeráz III (Pol III) promóter irányítása alatt íródik át . Az 50-70 nukleotidos transzkriptum egy stem-loop szerkezetet alkot, amely egy 19-29 bp hosszúságú, kettős szálú RNS régióból (a szár) áll, amelyet egy túlnyomórészt egyszálú RNS régió (a hurok) és egy dinukleotid 3′ túlnyúlás hidal át. Az egyszerű stem-loop shRNS átíródik a sejtmagban, és a pre-mikroRNS-hez hasonlóan belép az RNSi útvonalba. A hosszabb (> 250 nukleotidos) mikroRNS-adaptált shRNS egy olyan kialakítás, amely jobban hasonlít a natív pri-mikroRNS molekulákra, és egy shRNS szárszerkezetből áll, amely tartalmazhat mikroRNS-szerű eltéréseket, amelyet egy hurok hidal át, és amelyet 5′ és 3′ endogén mikroRNS szekvenciák szegélyeznek . A mikroRNS-hez igazított shRNS, hasonlóan az egyszerű szár-hurok hajtűhöz, szintén átíródik a sejtmagban, de feltételezhetően korábban lép be az RNSi útvonalba, hasonlóan az endogén pri-mikroRNS-hez.

A shRNS technológiák DNS-alapúak, ami rugalmasságot biztosít a vektor tervezésében. A legtöbb vektoralapú shRNS-rendszer szelektálható markert tartalmaz, amely lehetővé teszi a nem sikeresen transzfektált vagy transzdukált sejtek eltávolítását, valamint a tartós génkiütéssel rendelkező sejtek fenntartását. A shRNS-expressziós kazetták vírusvektorrendszerekbe is beépíthetők, beleértve a retrovírust, adeno-asszociált vírust, adenovírust és lentivírust, amelyek lehetővé teszik a stabil integrációt a gazdagenomba és az abból történő expressziót. Ezek a vírusos stratégiák lehetővé teszik a shRNS bejuttatását a transzfekcióra refrakter sejtvonalakba. A shRNS-t expresszáló sejtek nyomon követésére fluoreszcens markerek (például zöld vagy vörös fluoreszcens fehérje ) is alkalmazhatók. A shRNS teljesítményét számos tényező befolyásolja, beleértve a transzdukció vagy transzfekció hatékonyságát, a shRNS expresszióját vezérlő promótert és az epigenetikai módosításokat (amelyek a shRNS expresszió elnémításához vezethetnek). Továbbá, az egyes tényezőknek a vektor teljesítményére gyakorolt hatása a sejtvonaltól vagy sejttípustól függően eltérő lehet. A SMARTchoice promóter és riporter opciók rendelkezésre állnak, hogy segítsék a kutatókat a shRNS-expresszióhoz és a géncsendesítéshez optimális promóterek kiválasztásában. Végül, amikor ezeket a shRNS-expressziós kazettákat indukálható promóterekkel kapcsolják össze, mint a SMARTvector indukálható lentivirális shRNS vagy a TRIPZ vektorrendszer esetében, a kutatók tanulmányokat tervezhetnek a génexpresszió időbeli és térbeli modulálására .

Videoanimáció: RNS interferencia

Hogyan juttatjuk a shRNS-t a sejtbe?

A DNS-alapú shRNS sejtekbe juttatására két lehetőség van. Plazmidok esetében tipikus transzfekciós módszerek, például lipid transzfekciós reagensek használata vagy elektroporáció alkalmazható. A lentivirális részecskék kiváló választásnak bizonyulnak a nehezen transzfektálható sejtek esetében, illetve olyan helyzetekben, amikor nagy hatékonyságra van szükség, vagy sejtenként több konstrukciót kell eljuttatni. A legtöbb modern vektor szelektálható markerekkel rendelkezik, amelyek lehetővé teszik a kultúrában lévő, nem sikeresen transzfektált vagy transzdukált sejtek szelektív elpusztítását, így tiszta kultúra alakítható ki.

Mi befolyásolja a shRNS működését és specifitását?

A shRNS-rendszerek használatával történő sikeres RNSi egyik feltétele az optimális génkiütés. A shRNS-szekvenciák racionális tervezése nagyrészt a siRNS esetében kifejlesztett algoritmusokon alapul. Míg néhány siRNS tervezési szabály a shRNS-re is vonatkozik, a kifinomultabb shRNS tervezési algoritmusok a jövőben valószínűleg javítani fogják a shRNS-ek célgén-elnémítását . A funkcionális shRNS-szekvenciák előrejelzése érdekében a Dharmacon SMARTvector™ shRNS algoritmusa számos kritérium alapján választja ki a célszekvenciákat, beleértve a pozíciófüggő nukleotidpreferenciákat, a SMARTvector mikroRNS-alapú állványzatra jellemző másodlagos szerkezetet és termodinamikai stabilitási profilokat. Emellett a SMARTvector algoritmus számos kritériumot tartalmaz a specificitás növelésére.

A siRNS-ekhez hasonlóan bioinformatikai megközelítéseket lehet alkalmazni a célspecifikus shRNS-ek létrehozására, miközben minimalizálják a célponton kívüli hatások lehetőségét. A csendesítő intermedierek magas koncentrációja közismerten hozzájárul az off-target eseményekhez, de a intermedierek szintjét nehéz ellenőrizni, amikor a shRNS-eket exogén módon expresszálják. Számos publikáció dokumentált bizonyítékot arra, hogy bizonyos körülmények között az egyszerű stem-loop shRNS nagyfokú expressziója telítheti az endogén RNSi útvonalat, és nem kívánt fenotípusokhoz vezethet. Más tanulmányok szerint a mikroRNS-hez igazított shRNS használata csökkentheti a sejttoxicitást az in vivo RNSi-kísérleteknél, mivel ezeket a scaffoldokat mind a Drosha-DGCR8, mind a Dicer hatékonyabban dolgozza fel .

shRNS alkalmazások

a shRNS lehetőséget kínál a hosszan tartó géncsendesítésre. A vírusalapú shRNS transzdukciója hozzáférést biztosít olyan sejtekhez, például primer és neuronális sejtekhez, amelyeket hagyományos kationos lipid alapú stratégiákkal nehéz transzfektálni. A vírusalapú shRNS-eket a génfunkció egész genom léptékű értékelésére is használták a csendesítő konstrukciók pooljainak felhasználásával. Az összevont vagy tömbösített szűréseket ma már széles körben használják nagy áteresztőképességű szűrések elvégzésére, hogy azonosítsák a különböző folyamatokban szükséges géneket, mint például a rákos sejtek túlélése és proliferációja , a tumorszupresszor útvonal komponensei , az emlősök cirkadián órájának modulátorai , az epithelialis-mesenchymalis átmenet szupresszorai , a HIV-1 replikáció gazdaszervezeti közvetítői és a sejtmigráció szabályozói . Az összevont RNAi szűrés erejét kiterjesztették a génfunkció állati modellekben történő szűrésére is az in vivo biológia vizsgálatára .

Melyik shRNS eszköz felel meg az Ön igényeinek?

shRNS kiválasztási útmutató

A shRNS reagensek és könyvtárak választékát kínáljuk. Ez a gyors kiválasztási útmutató segít meghatározni az Ön egyedi igényeinek legmegfelelőbb lehetőséget.

Featured Products

shRNA – termékek

• Lentivírus vektor alapú reagensek az RNS interferenciához.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Tegyen okos, megalapozott döntéseket a sikeres géncsendesítéshez az Ön által érdekelt sejtekben.

SMARTvector Indukálható shRNS

• A legfejlettebb és legrugalmasabb egyvektoros indukálható shRNS a szigorúan ellenőrzött géncsendesítéshez.

Pooled Lentiviral Screening Libraries

• A kiváló minőségű poolok optimalizált felépítése, a teljes körű elemzési eszközök és a validált protokollok elengedhetetlenek a sikeres eredményhez, amikor poololt lentivirális könyvtárakkal szűrünk.

Featured Resources

shRNA – Resources

• Termékkal kapcsolatos útmutatók, GYIK és egyéb információk.

SMARTvector lentivirális shRNA – Tech Note

• A SMARTchoice shRNA kísérleti munkafolyamatát szuszpenziós sejtekben leíró technikai megjegyzés.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technical Manual

• A platform egy innovatív rendszer, amely ideálisan alkalmas RNS-mediált vizsgálatokhoz.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Kísérleti protokollok a GIPZ lentiviral shRNA használatával történő génkiütéshez.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) A génexpresszió stabil elnyomása RNSi által emlős sejtekben. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Kis interferáló RNS hatékony expressziója emberi sejtekben. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Az egér és a humán genomot lefedő második generációs shRNS könyvtárak. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Különböző promóterek funkcionális elemzése lentivirális vektorokban az egér embrionális őssejtek in vitro differenciálódásának különböző szakaszaiban. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentivirális vektorok fokozott génexpresszióra humán vérképző sejtekben. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-like family of transcription factor 9, a differenciálódással kapcsolatos transzkripciós faktor elnyomja a Notch2 jelátvitelt és gátolja a glioblasztóma-kezdeményező őssejteket. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji koordinálja a PRC2 enzimatikus aktivitás és a célgének foglaltságának szabályozását pluripotens sejtekben. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) A citoplazmatikus FANCA-FANCC komplex kölcsönhatásba lép és stabilizálja a citoplazma-diszlokalizált leukémiás nukleofoszmin fehérjét (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatalitás egerekben a sejtek mikroRNS/rövid hajtű RNS útvonalainak túltelítődése miatt. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Artificial miRNSs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC couples microRNS biogenesis and post-transcriptional gene silencing. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Highly parallel identification of essential genes in cancer cells. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Science 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Candidate biomarkers of response to an experimental cancer drug identified through a large-scale RNA interference genetic screen. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) A KLF17 az epiteliális-mesenchymális átmenet és a metasztázis negatív szabályozója emlőrákban. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) A genom-szintű rövid hajtű RNS szűrés jurkat T-sejtekben a produktív HIV-1 replikációhoz hozzájáruló humán fehérjékre. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac function and survival during heart failure. Circulation 124(14):1537-1547.