Pozitív funkcionális szinergiája Click-kémiával összeállított, szerkezetileg integrált mesterséges fehérje-dimereknek

Click-kémiai határfelületi helyek

Feltételeztük, hogy egy fehérje felületének a társulás szempontjából kompatibilis területei nagyobb valószínűséggel hoznak létre integrált szerkezetet kölcsönösen kompatibilis nem kovalens kölcsönhatások kialakításával. Mivel a fehérjék monomerek, ezek a kölcsönhatások a legjobb esetben is csak gyengék és átmeneti jellegűek, így nem maradnak fenn, ezért arra gondoltunk, hogy szükségünk van egy molekuláris “csavarra” az interfészhely részeként, amely elősegíti és stabilizálja az új kölcsönhatásokat. Az első lépés a célfehérjék olyan régióinak azonosítása, amelyekben rejlik a kölcsönhatás lehetősége. A ClusPro 2.040 (cluspro.org) programot használtuk a potenciális dimerkonfigurációk létrehozására. A kimeneti sfGFP homodimer modelleket a RosettaDock41,42 segítségével finomítottuk, elemeztük és rangsoroltuk (1. kiegészítő táblázat). A legmagasabb rangsorolt konfiguráció az 1b. ábrán látható (amely a legközelebbi modell az alábbiakban meghatározott szerkezethez; vide infra), a következő 4 rangsorolt konfiguráció pedig az 1. kiegészítő ábrán látható. Míg az egyik sfGFP-nek a másikhoz képest különböző orientációit figyeltük meg, a dokkolás kimutatta, hogy a 145-148, 202-207 és 221-224 maradékok rutinszerűen hozzájárultak a dimer interfészhez. A két fehérje összecsavarozásához genetikailag kódolt bioorthgonális Click-kémiát alkalmaztunk (1a. ábra). A például a diszulfidkötésekkel szembeni előnyök közé tartoznak a hosszabb oldalláncok a potenciális sztérikus ütközések leküzdésére, a jobb keresztkötés-stabilitás és a nem szimmetrikus (különböző monomereken különböző összekötő maradékok) és heterodimerek tervezett 1:1 módon történő előállításának képessége (vide infra).

A dimermodellek alapján három maradékot választottunk ki a két Click-kompatibilis ncAA-val, SCO43 (feszített alkin) és azF (azid)44,45 (1a. ábra) helyettesítésére. A H148-at és a Q204-et a feltételezett dimer interfészen való elhelyezkedésük alapján választottuk ki (1b. ábra és 1. kiegészítő ábra). Mindkét maradékról ismert, hogy könnyen módosulnak kis molekulájú ciklooktin adduktokkal azF beépülésekor34,46 , és közel helyezkednek el a funkcionális központhoz, az sfGFP kromofórjához (CRO) (1b. ábra). A gélmozgékonysági eltolódás-elemzés kimutatta, hogy a dimerizáció sikeres volt (1c., d. ábra); ezt tömegspektrometriás elemzéssel is megerősítették (2. kiegészítő ábra). A 132. maradéknak nem a dimer határfelületen kellett volna lennie (1b. ábra és 1. kiegészítő ábra), de ismert, hogy kompatibilis egy sor feszített alkin adduktal, a színezékektől46 a szén nanocsöveken35 át az egyszálú DNS-ig36. Így jó tesztként szolgál a fehérje-fehérje határfelületek és a Click-reakció kompatibilitás előrejelzésének képességére. Annak ellenére, hogy a 132. maradék a felületnek kitett, nem figyeltünk meg dimerterméket sfGFP132azF és SCO-t tartalmazó fehérje használatával (3. kiegészítő ábra), ami jelzi a felületi határfelületi kompatibilitás fontosságát és az in silico elemzés hasznosságát a click-kémiával kompatibilis helyek azonosításában. Vagy sztérikus ütközések és/vagy más régiókban hosszabb ideig fennmaradó fehérje-fehérje kölcsönhatások akadályozhatják a kovalens keresztkötést a 132-es maradéknál.

Pozitív funkcionális kapcsolás az sfGFP148x2 dimer

kialakulásakor

H148 H-kötést képez a CRO-val (ábra. 1b), és fontos szerepet játszik a protonok ingázásában, amely szabályozza az alapállapotban jelen lévő semleges A (λmax ~ 400 nm, CRO A) és az anionos B forma (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 populációját. Az sfGFP-ben a B forma dominál, de a H148 helyett azF beépítésével (sfGFP148azF) a H-kötés eltávolításával az A állapot válik uralkodóvá33,34 (2a. ábra és 1. táblázat). Az SCO beépítése a 148-as maradékban (sfGFP148SCO) hasonló hatást vált ki, a CRO A állapot dominál, de a kisebb CRO B forma kisebb vöröseltolódása (λmax 492 nm) mellett (2a. ábra és 1. táblázat).

Az sfGFP148azF és az sfGFP148SCO dimerizációja két jelentős pozitív hatást eredményez: (i) a fluoreszcencia bekapcsolása ~490 nm-en a CRO B forma elősegítése miatt; (ii) jelentősen megnövelt fényerő a 490 nm-en megnövekedett moláris abszorpciós együttható révén (2a. ábra és 1. táblázat). A fő gerjesztési csúcs a dimerizáció során vörösre tolódik (λmax 492 nm) az sfGFPWT-hez (λmax 485 nm) képest (3. kiegészítő táblázat). A 490:400 nm-es abszorbanciaarány egy nagyságrenddel eltolódik a monomerek esetében ~0,5-ről ~5-re a dimer esetében, és a CRO B forma dominál a dimer abszorbancia spektrumában (2a. ábra) annak ellenére, hogy nyilvánvalóan nincs olyan faj, amely helyettesíteni tudná a H148 imidazolcsoport szerepét. Az sfGFP148azF kis molekula-adduktokkal vagy fotoaktiválással történő módosításának korábbi példái a legjobb esetben is csak részleges átalakulást eredményeznek CRO B formává33,34. Az abszorbancia 10-szeres változása a fluoreszcencia emisszióban is tükröződik; a 490 nm-en történő gerjesztés ~20-szor nagyobb emissziót eredményez, mint bármelyik monomer (2a. ábra). Emellett a dimer még az eredeti szuperfolder sfGFPWT-vel összehasonlítva is fokozott funkciót mutat (2b. ábra és 1. táblázat). A moláris abszorbancia és a fényerő ~320%-kal nőtt az sfGFP148x2 esetében (~160%-kal CRO alapon) (2b. ábra), ami magasabb, mint ami egy egyszerű additív növekedés esetén várható, ha a monomer egységek egymástól függetlenül hatnak.

A biortogonális kapcsolat jelentőségének vizsgálatához egy klasszikus diszulfid alapú kapcsolatot konstruáltunk a H148 ciszteinné mutálásával. Az sfGFPH148C variánsok dimerizálódtak, de csak Cu2+ jelenlétében (4. kiegészítő ábra). A spektrális tulajdonságok arra utaltak, hogy a dimer kevésbé fluoreszkált az sfGFP148x2 és az sfGFPWT változatokhoz képest (4. kiegészítő ábra). Az sfGFPH148C monomer a várt CRO B-ről CRO A-ra váltást mutatott. Bár az sfGFPH148C dimerizációjánál megfigyelhető volt a CRO A-ról CRO B-re való váltás, a dimer CRO-moláris abszorbanciája alacsonyabb volt, mint az sfGFPWT-é, és lényegesen kisebb, mint az sfGFP148x2-é; az A állapot jelentős populációja továbbra is megfigyelhető volt. A dimer sfGFPH148C fluoreszcens emissziója 490 nm-en történő gerjesztéskor körülbelül fele volt az sfGFPWT-ének. Így a biortogonális megközelítés a klasszikus diszulfidkötésnél jobban teljesítő dimer fajt hozott létre.

A funkcionális kapcsolás molekuláris alapja az sfGFP148x2-ben

Az sfGFP148x2 kristályszerkezete (a statisztikát lásd a 2. kiegészítő táblázatban) azt mutatja, hogy a monomerek kiterjedt dimer interfészt alkotnak, a két CRO-központot összekötő hosszú távú kölcsönhatásokkal. Az sfGFP148x2 monomer egységei egymáshoz képest ~45°-kal eltolt, kvázi szimmetrikus fej-farok elrendezésben helyezkednek el (3a. ábra). Az antiparallel egymás melletti monomerelrendezés áll a legközelebb a legmagasabb rangú modellhez (1. kiegészítő ábra és 1. kiegészítő táblázat). Az új triazol keresztkötés elektronsűrűsége egyértelműen meghatározott (3b. ábra), és a hosszúkás anti-1,4-triazol kapcsolatot alkotja, amely részben eltemetve van és szorosan kapcsolódik mindkét monomer egységhez, így a dimer határfelület szerves részét képezi (3c. ábra). A CRO-k egymástól 15 Å távolságra vannak, egymás felé mutatva (3a. ábra).

A határfelület a természetes dimerekhez48 hasonló tulajdonságokkal rendelkezik. A határfelület eltemetett területe ~1300 Å2, amihez általában mindkét monomerből ugyanazok a maradékok járulnak hozzá (3c, d ábra). A H-kötések fontos szerepet játszanak: az E142, N146, S147, N149 és N170 maradékok mindkét monomerből nyolc részegység közötti H-kötéshez járulnak hozzá (3b. ábra). A szerkezet azt mutatja, hogy a természetes dimer interfészek utánozhatók és stabilizálhatók Click-kapcsolatos monomerek alkalmazásával, amelyek az eredeti modellezés szerint megvalósíthatóak, de valószínűleg túl gyengék vagy átmeneti jellegűek ahhoz, hogy a beágyazott kapcsolat nélkül fennmaradjanak. Így elképzelhető, hogy a mi megközelítésünk felhasználható a szélesebb értelemben vett átmeneti gyenge fehérje-fehérje kölcsönhatások stabilizálására, és így meghatározott interfészek kialakítására.

A dimerizáció konformációs változások sorozatát indukálja egy hosszú távú kölcsönhatási hálózat kialakításához, amely az sfGFP bekapcsolásának és a fényerő fokozásának mechanizmusa mögött áll. Az sfGFP148azF szerkezet (PDB 5BT0)34 azt mutatja, hogy a 148azF hasonló pozíciót foglal el, mint a H148 az sfGFPWT-ben, de nem tud a CRO fenol OH-csoportjával való kritikus H-kötéstől, amely elősegíti a CRO B állapot kialakulását. A dimerizáció során a 148azF módosítása a 148SCO-val való triazolkapcsolat kialakításával a rokon monomerben a gerinc és az oldallánc pozíciójának megváltozását eredményezi, ami egy lyukat okoz, amelyet most egy vízmolekula foglalhat el a dimerben (W1azF a 4a. ábrán). A víz H-kötést tud létesíteni a CROazF-hez és a 148azF gerincoszlop-karboniljához (4. ábra). Az sfGFP148SCO monomer egységben is van egy ekvivalens víz (W1SCO), amely hasonló kölcsönhatásokat alakít ki. Ezek a strukturált vízmolekulák képesek pótolni a H148 eltávolításakor elveszett H-kötéses kölcsönhatást, így aktiválva a dimert a CRO B alapállapotban történő kialakulásának elősegítésén keresztül. A vízmolekulák a dimer határfelületén is eltemetve vannak, így a dinamikus csere az ömlesztett oldószerrel sokkal kisebb lesz. Továbbá, a két CRO-t most egy kiterjedt, túlnyomórészt vízhálózat köti össze, amely átível a dimer határfelületen (4b., c. ábra). Az alagút összetételének elemzése kimutatta, hogy minden egységben három vízmolekula (W1azF/SCO, W2azF/SCO és W3azF/SCO) szimmetrikus; a W4 az F145SCO gerincével kombinálva biztosítja a dimer határfelületen átívelő hidat, amely összeköti a két vízhálózatot. Így a dimerizáció egy kiterjesztett, monomerek közötti, vízben gazdag H-kötéses hálózatot hoz létre, így elősegítve az A állapotú CRO-ból a B-formába való átváltást.

A sfGFP148x2 egymolekulás fluoreszcenciaanalízise

A teljes belső reflexiós fluoreszcencia (TIRF) mikroszkópiát használtuk az sfGFP148x2 dimerek fluoreszcens viselkedésének vizsgálatára egymolekulás szinten. Az egyes sfGFP148x2 dimerek fluoreszcencia-intenzitásának időbeli lefolyása az intenzitásállapotok tartományát mutatta, ahol a ~80-100 számolású fluoreszcencia dominált, és nagyobb élettartamot mutatott, mint a magasabb intenzitású állapotok alpopulációja, amelyeket rövid kitérések jellemeztek a ~100 és 300 számolású intenzitások tartományába (2c. ábra). A fluoreszcencia-nyomok szintén hosszan tartó fotostabilitást mutatnak, hosszú fotobleachinggal (2c. ábra és 5. kiegészítő ábra). Ehhez képest az sfGFPWT gyorsabban fotobleachel, a fluoreszcencia-nyomok egyetlen intenzitású állapotot mutatnak, amelyben a bekapcsolt állapotok általában rövidebb ideig tartanak (6. kiegészítő ábra). Továbbá a monomer sfGFPWT néha egy kezdeti sötét, nem fluoreszkáló állapotban volt, mielőtt a fluoreszcencia és az azt követő fotobleaching megindult volna (6. kiegészítő ábra). A fotobleachingot és az átmeneti nem fluoreszkáló állapotok (villogás) elfoglalását megelőző átlagos folyamatos fluoreszcencia-“bekapcsolási idő” kivonása azt mutatja, hogy az sfGFP148x2 hosszabb folyamatos fluoreszcencia-periódusokat mutat (átlagosan 0,9 s), mint az sfGFPWT (0,65 s). Tekintettel a mért egymolekulás fluoreszcencia-intenzitás hasonlóságára, a megnövekedett ON-idők és a fotobleaching élettartam valószínűleg hozzájárul az sfGFP148x2 állandósult állapotú együttes méréseiben megfigyelt megnövekedett fluoreszcenciához (2a. ábra).

A dimer-nyomokban megfigyelt fluoreszcencia-állapotok tartományának racionalizálására tett kísérletként elkészítettük az összes mért intenzitás hisztogramját (2c. ábra). Az sfGFPWT-vel (6. kiegészítő ábra) ellentétben, amely egyetlen log-normális eloszlást49 mutat, az sfGFP148x2 egy kétkomponensű illeszkedést50 részesített előnyben (2c. ábra). A mért intenzitáseloszlás egy domináns alacsonyabb intenzitású csúcsot (~90 counts) és egy részben átfedő magasabb intenzitású csúcsot mutat, ami az egymolekulás fluoreszcencia-nyomokban megfigyelt, magasabb intenzitású állapotokba való rövid kitérések következménye. Míg egy két együtt elhelyezkedő, egymástól függetlenül aktív fluorofórból álló dimer esetében általában bimodális intenzitáseloszlás várható, ahol az egyes fluorofórok egymás után fotobleachelnek, az egymolekulás intenzitás-időfolyamatok nem felelnek meg ennek a modellnek, és két jól meghatározott állapot hiányát mutatják. Az sfGFPWT egyszerű be/kikapcsolt állapotú viselkedése ritkán figyelhető meg a dimer-nyomokban, amelyek maguk sem a két monomer nyomvonal várt adduktjaként jelennek meg, hanem összetettebb viselkedést mutatnak.

Elősített funkció az sfGFP204x2 dimer kialakításakor

Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a különböző kapcsolódási helyek milyen funkcionális hatásokat válthatnak ki, megvizsgáltuk a fentebb konstruált alternatív sfGFP204x2 dimert (5a. ábra) (1d. ábra). Úgy találtuk, hogy a dimerizáció a spektrális tulajdonságokat a monomer vagy sfGFPWT fehérjék egyszerű hozzáadásánál jobban javította, ami ismét kiemeli a dimerizáció szinergikus előnyeit. Az azF vagy az SCO beépítése a 204-es maradéknál kevés hatással volt a spektrális tulajdonságokra az sfGFPWT 46-hoz képest (5b. ábra és 1. táblázat). A monomer formákban a B CRO forma dominált; mind a moláris abszorbancia, mind az emissziós intenzitás hasonló volt egymáshoz és az sfGFPWT-hez. Az sfGFP204SCO fluoreszcencia emissziója kissé csökkent (az sfGFPWT 80%-a; 1. táblázat). Az sfGFP204x2 dimer kialakulásakor (a bizonyítékot lásd az 1d. ábrán és a 2. kiegészítő ábrán) a spektrális elemzés funkcionális javulást mutatott az alapvető spektrális paraméterek: a moláris abszorbancia együttható (ε) és a fluoreszcencia emisszió tekintetében (5b. ábra és 1. táblázat). A dimerizáció során az ε a kiindulási monomerekhez képest akár 400%-kal, 160 000 M-1 cm-1-re nőtt. Ez 80 000 M-1 cm-1 cm-1 átlagos CRO-moláris abszorbanciának felel meg, ami a kiindulási monomerekhez képest csaknem kétszeres fényerősséget jelent, és 31 000 M-1 cm-1 cm-1el magasabb az sfGFPWT-hez képest. A megnövekedett fényelnyelő képességgel összhangban a fluoreszcencia emisszió is fokozódott; a CRO-ra vonatkoztatott normált emisszió 180%-kal magasabb volt, mint az sfGFP204azF monomeré. A Strickler-Berg51 számítás (huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/ weboldal) segítségével a fluoreszcencia élettartama az sfGFPWT esetében 3,2 ns-ról 0,92 ns-ra csökken az sfGFP204x2 esetében. Így az sfGFP148x2-hez hasonlóan az sfGFP204x2 dimer szerkezetében is nagyobb az elektronikus gerjesztés és a fluoreszcencia kibocsátás valószínűsége a monomer formához képest (a dimerek spektrális összehasonlítását lásd a 8. kiegészítő ábrán). Ez annál is inkább lenyűgöző mindkét dimer forma esetében, mivel az sfGFPWT a zöld fluoreszcens fehérje teljesítményének etalonja.

A szimmetria jelentősége a szinergia szempontjából

A természetes fehérje homodimerek általában szimmetrikusak1,52 és ezt a szimmetriát a mi mesterséges dimerünkben egy közös keresztkötési maradékon keresztül utánoztuk. Megvizsgáltuk a közös keresztkötés-maradék (mint a szerkezeti szimmetria mimikája) jelentőségét a funkcionális szinergia szempontjából. A biortogonális kémia előnye, hogy a kölcsönösen kompatibilis reakciófogantyúk lehetővé teszik meghatározott párok felépítését (pl. 148 + 204 = 148-204 és nem 148-148 vagy 204-204), így megelőzhető a nemkívánatos termékek képződése, amelyeket nehéz lesz elválasztani.

Olyan dimereket hoztunk létre, amelyek a 148 és 204 maradékot a két elérhető kombinációban (148SCO+204azF és 148azF+204SOC) kötötték össze. Az állandósult állapotú fluoreszcencia kimutatta, hogy mindkét dimerformában egyértelműen jelen volt a CRO protonált és deprotonált formája (6a, b ábra). A 148azF-204SCO kapcsolt dimer az A és B formák relatív populációjának változását mutatta, a 490 nm-en mért moláris abszorbancia együttható jelentős növekedésével (6a. ábra); ez majdnem kétszerese volt az eredeti sfGFP204SCO-nak és ~30%-kal magasabb, mint amit a monomer spektrumok egyszerű összeadásával előre jeleztek. A 400 nm-es csúcs relatív magassága hasonló maradt mind az sfGFP148azF, mind a 148azF-204SCO kapcsolt dimerben, ami arra utal, hogy a deprotonált forma populációja hasonló a dimerben, mint az eredeti monomerben. A 148SCO-204azF kombinációval történő dimerizáció megváltoztatta a protonált és deprotonált formák relatív populációját, de a 400 nm-es abszorbanciacsúcs csökkenése nem járt együtt a 490 nm-es csúcs egyidejű növekedésével (6b. ábra). Valójában a dimerizáció nagymértékben káros volt, mivel mindkét fő abszorbanciacsúcs alacsonyabb moláris abszorbancia együtthatóval rendelkezett, mint a monomerek egyszerű addíciós spektrumai (6b. ábra). Egyértelmű, hogy az aszimmetrikusan kapcsolt dimerek kevésbé fluoreszkálnak és a két CRO-állapot jelentős kevert populációját tartalmazzák a szimmetrikusan kapcsolt dimerekhez képest, így ebben az esetben a szimmetriának fontos funkcionális következményei vannak.

Heterodimerek és funkcionális integráció

A heterodimerek, amelyekben a dimer két különböző fehérjéből áll, egy gyakran megfigyelt alternatív dimerizációs állapot1,2. Ez lehetővé teszi olyan új komplexek tervezését is, amelyekben funkcionálisan különböző fehérjék kapcsolódhatnak össze. A bioortogonális csatolás előnye, hogy két különböző fehérjeegységből álló, definiált, egyfajú (hetero)dimerek hozhatók létre (azaz A + B = A-B, nem pedig A-A, B-B, A-B keverék, amelyet nehéz lehet szétválasztani). A sárga fluoreszcens fehérje Venus29-et választottuk az sfGFP partnerfehérjének, tekintettel a kettő közötti spektrális átfedésre (9. kiegészítő ábra). A szekvencia különbségeket a 10. kiegészítő ábra mutatja.

SfGFP148SCO-t kombináltuk a megfelelő azF tartalmú Venusszal (Venus148azF), hogy létrehozzuk a GFVen148-at (a bizonyítékokat lásd a 11. kiegészítő ábrán). Új spektrális jellemzők jelennek meg, ami arra utal, hogy egy integrált rendszer jött létre. A GFVen148 képződése olyan dimert hoz létre, amely az sfGFP148SCO-hoz vagy a Venus148azF-hez képest jobb fényességet mutat (7a. ábra és 3. kiegészítő táblázat). Érdekes módon a dimer spektrális tulajdonságai az egyedi monomerek közöttiek, jelentős csúcsszélesedés nélkül (7a., b. ábra és 12a. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy a két CRO-központ funkcionálisan integrálódott a fluoreszcens emissziót tekintve. A fő λmax 505 nm, az sfGFP (492 nm) és a Venus (517 nm) között helyezkedik el. A B CRO formának megfelelő ε (490-510 nm-es régió) jelentősen (~4-5-szörösére) nő, magasabb, mint a monomerek egyszerű additív spektruma, míg az A CRO populáció csökken, de még mindig megfigyelhető (7a. ábra). Ehhez párosul az 505 nm-es gerjesztéskor az emissziós intenzitás ~4-szeres növekedése (7b. ábra). Egyetlen emissziós csúcs figyelhető meg, amely szintén köztes a két monomer között, függetlenül a gerjesztés hullámhosszától (λEM 517 nm-nél; 7b, c ábra); 490 nm-es gerjesztésre (amely mindkét CRO-t képes gerjeszteni) inkább egyetlen, mint kettős vagy kiszélesített csúcsot figyeltünk meg, ami arra utal, hogy egyetlen faj emittál. Az egyedi monomer spektrumok additív spektruma, amely két egymástól függetlenül ható fehérjét szimulál, alátámasztja az új integrált funkció elképzelését, mivel a mért GFVen148x2 emissziós profilhoz képest szélesebb és vörösre eltolódott (12b. kiegészítő ábra). A 400 nm-es gerjesztésre történő emissziót is megmértük, mivel a Venus148azF-nek ezen a hullámhosszon a GFVen148-hoz képest kicsi az abszorbanciája. Az emisszió intenzitása 30-szor nagyobb volt a GFVen148 esetében a monomer Venus148azF-hez képest, az emisszió csúcspontja 517 nm-nél volt (7c. ábra és 12c. kiegészítő ábra). A GFVen148 ahelyett, hogy klasszikus FRET-et mutatna, ahogyan az várható lenne (vide supra), úgy tűnik, hogy a fluoreszcencia-kibocsátás szempontjából egyetlen entitásként viselkedik. Ez arra utalhat, hogy a két CRO most túlnyomórészt egy fajként viselkedik, amelyben szerepet játszanak az sfGFP148x2 esetében megfigyelt strukturális szempontok (például a vízhálózat). A CRO jelentős semleges A állapotának jelenléte arra utal, hogy a két monomer egység nem teljesen szinkronizált. Ez azonban nem vonja kétségbe a dimerizáció egyértelmű hatását az olyan újszerű spektrális tulajdonságok létrehozásában, mint amilyenek a GFVen148-nál megfigyelhetők.

Az sfGFP-hez hasonlóan azF beépítése a Q204 helyett (Venus204azF néven) kevés hatással volt a Venus spektrális tulajdonságaira (3. kiegészítő táblázat). A 204 SPAAC-on keresztül történő kovalens kötés (GFVen204 előállítása) sikeresen létrehozott egy dimert (11. kiegészítő ábra). A GFVen204 egyesítette a két monomer spektrális tulajdonságait, így egy olyan faj jött létre, amelynek λMax értéke 490 és 514 nm-en egyaránt (1:1,2 arány) (7e., f. ábra és 3. kiegészítő táblázat). A Venus204 szintén elnyelődik 490 nm-en, de 1:2,7 arányban az 514 nm-hez képest. A dimerek képződése ismét megnövelte a moláris abszorpciót az egyedi monomerek abszorpciója fölé; nevezetesen az ε ~26 000 M-1 cm-1 -el (~27%) nőtt a Venushoz kapcsolódó λmax (514 nm) esetében, ahol az sfGFP esetében kevés a hozzájárulás. A monomerek közötti kommunikáció vizsgálatára négy különböző hullámhosszon történő gerjesztésre történő fluoreszcencia emissziót figyeltünk meg: 400 nm (csak sfGFP); 450 nm (sfGFP, kisebb Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venus váll); 510 (Venus, kisebb sfGFP). Minden gerjesztési hullámhosszon az egyetlen egyértelmű emissziós csúcs 528 nm-nél volt (7b. ábra), ami a Förster-rezonancia-energiaátvitel (FRET) révén történő kommunikációt jelző Venusnak felel meg. Az sfGFP204SCO-nak megfelelő emissziós csúcs (~510 nm) még az sfGFP-re jellemző alacsonyabb hullámhosszon történő gerjesztéskor sem volt megfigyelhető. Nem volt megfigyelhető a GFVen148-ra jellemző köztes emissziós csúcs sem, ami rávilágít a 148 heterodimer újszerű tulajdonságaira. A legjelentősebb különbség 400 nm-es gerjesztésnél volt megfigyelhető, ahol a GFVen204 esetében a Venus204azF-hez képest 14-szeres emissziós intenzitásnövekedés figyelhető meg 528 nm-en (7f. ábra, betét). A számított relatív FRET-hatékonyság a spektrális bontás után kb. 90% volt. A két funkcionális centrum tehát energiatranszfer révén (7g. ábra) rendkívül hatékonyan kommunikál egymással.