A mozgékonyság szabályozása a központi pár által
A külső ingerekre adott mozgékonysági változások kétféleképpen alakulhatnak. Az inger megváltoztathatja a véletlenszerű átorientálódás gyakoriságát, ahogy az a baktériumoknál előfordul, így a kedvező irányú mozgást jutalmazza, vagy az inger közvetlenül szabályozhatja a mozgékonyságot, így a szervezet az ingerhez képest meghatározott irányba fordul (pozitív taxáció esetén az inger felé, negatív taxáció esetén elfelé). Az ilyen taktilis elforduláshoz lokalizált receptorokra van szükség, amelyek antennaként működhetnek, és olyan motilitási apparátusra, amely irányítottan szabályozható (Foster és Smyth, 1980). Az egyszerű stop-reorient-start típusú szabályozás nem igényel kifinomult motilitásszabályozást. A flagellákban az irányszabályozás a hullámforma és az ütésfrekvencia összehangolt változását és ezért kifinomultabb szabályozó apparátust igényel. A központi pár-radialis küllőrendszer tölti be ezt a szerepet a 9+2 csillókban és a flagellákban, amint azt a Chlamydomonasban a legelegánsabban bemutatták (1D ábra). Ez az egysejtű biflagellás alga a fototaktikus ingerekre úgy reagál, hogy megváltoztatja két flagellájának relatív hullámformáját, lökési sebességét és ütési frekvenciáját (Witman, 1993). A rendelkezésre álló bizonyítékok arra utalnak, hogy a fototaxis egy jelátviteli útvonalat foglal magában a központi apparátustól a sugárirányú küllőkön keresztül egy duplájához kapcsolódó szabályozó komplexhez, amely aztán a dyneinhez kapcsolódó fehérje kinázok és foszfatázok változásain keresztül módosítja a dynein aktivitás mintázatát és ezáltal a kanyarképzést és terjedést (Porter és Sale, 2000; Smith és Yang, 2004).
Míg az aszimmetrikus központi apparátus kialakításának több lehetséges módja is létezhetett, a két mikrotubulusból álló minimális állványzatra épülő lehetett az első, ami a protocilium minimális megváltoztatását igényelte, elsősorban egy új összeszerelési iniciációs hely hozzáadását az átmeneti zónában egy olyan szerkezettel (radiális küllőkkel) együtt, amely a központi apparátusból a dublett-asszociált dyneinek felé irányuló jeleket továbbítja. Elképzelésünk szerint a radiális küllők a dyneinszabályozásból fejlődtek ki a dubletták lapjain, ahol a bázisuknál kölcsönhatásba léptek a dublettákhoz kapcsolódó dyneinszabályozó komplexszel, a csúcsuknál pedig a dubletták egy másik sorában vagy a kérgi szinguláris mikrotubulus-citoszkeletonon lévő mikrotubulus-asszociált fehérjékkel. Figyelemre méltónak tűnik, tekintve annak valószínűségét, hogy a flagelláris dyneinek a citoplazmatikus dyneinekből fejlődtek ki, hogy e két dyneincsalád esetében nem ismertek közös szabályozó mechanizmusok. Ez azonban inkább a jelenlegi ismereteink hiányát tükrözheti, mint a konzervált mechanizmusok hiányát. A Chlamydomonas dynein szabályozó komplexének egyik fehérjéjének közelmúltbeli molekuláris elemzése olyan elsődleges szerkezetet mutatott ki, amely valóban hasonlóságot mutat a citoplazmatikus fehérjékkel, de a citoplazmatikus dyneinnel való kapcsolatot nem sikerült megállapítani (Rupp és Porter, 2003).
A központi pár mikrotubulusaiból és a radiális küllőkből származó projekciók és a dynein aktivitás specifikus változásait kiváltó radiális küllők közötti kölcsönhatás specifikus mintázatainak feltárása továbbra is nagy rejtély. A laboratóriumunk legújabb eredményei, beleértve a normális központi pár szerkezetének elemzését, a központi pár összeszerelési hibás mutánsok jellemzését és a központi pár orientációjának meghatározását a kanyarodás során, korlátozzák a CP dynein szabályozásának modelljeit. Itt megkísérlünk egy olyan hipotézist szintetizálni a központi pár szabályozásáról, amely összhangban van ezekkel az eredményekkel.
A Chlamydomonas és Tetrahymena axonémák korábbi vékonyszelvényes elektronmikroszkópos vizsgálata, valamint a Tetrahymena csillókból (Chasey, 1969) és patkány spermium flagellákból (Olson és Linck, 1977) származó központi párkomplexek negatív festésű preparátumai feltárták a központi párkomplexek aszimmetrikus szerkezetét, és C1-ként határozták meg a keresztmetszetben hosszabb nyúlványokkal és 32 nm-es ismétlődési periodicitással rendelkező CP mikrotubulust, míg a másik (C2) rövidebb nyúlványokkal és csak 16 nm-es ismétlődésekkel rendelkezik. A vad típusú központi párkomplexek és a pf6 és cpc1 összeszerelő mutánsokból származó központi párkomplexek kereszt- és hosszanti vékony metszeteinek összehasonlításával meghatároztam a Chlamydomonasban található C1 és C2 asszociált projekciók többségének szerkezeti viszonyait és ismétlődési periódusait. A gyorsfagyasztott, mélymaratott preparátumok sztereoképei által nyújtott felületi nézetek megerősítették és kibővítették ezeket a következtetéseket, és a központi pár meglehetősen teljes 3-d rekonstrukcióját eredményezték (Mitchell, 2003a). Ezek a vizsgálatok modellt adnak a központi pár potenciális küllős kölcsönhatási helyeiről, és különösen a CP egyébként hengeres felületén a szomszédos küllősfejek felé néző mikrotubulus-felületek mentén mutatnak diszkontinuitásokat. Ugyancsak hangsúlyos a CP komplex általános aszimmetriája, ami egyedi küllős kölcsönhatásokra utal a CP henger körüli különböző radiális pozíciókban. A pf6 (Rupp és mtsai., 2001) és a cpc1 (Mitchell és Sale, 1999; Zhang és Mitchell, 2004) gének klónozása és géntermékeik azonosítása nem azonosított nyilvánvaló jelölteket a radiális küllőkkel kölcsönhatásba lépő fehérjékre, de a C2 mikrotubuluson lévő kinezinszerű fehérje (Klp1) (Bernstein és mtsai., 1994) vonzó jelölt a küllőkhöz kötődő fehérjékre. Nemrégiben kimutattuk, hogy a Klp1-et kiütő sejtekben a flagellák drámaian csökkent frekvenciával verdesnek (Mitchell és Yokoyama, 2003).
EM vizsgálatok azt mutatják, hogy a CP egyes organizmusokban fix orientációt tart fenn a sejttesthez és a külső kettősökhöz képest, míg másokban a CP változó orientációjú. Filogenetikai szempontból úgy tűnik, hogy a fix orientáció olyan organellumoknál, amelyeknek fix hajlítási síkjuk van, mint például a ctenophore fésűs lemezes csillók (Tamm és Tamm, 1981) és számos metazoán spermium (Sale, 1986), származékos egyszerűsítésnek tűnik. Szélsőséges példákban a C1 és C2 mikrotubulusok állandó összeköttetésekkel (akár módosított küllőkkel, akár járulékos struktúrákkal) kapcsolódnak a 8-as, illetve a 3-as kettőshöz. Az ellenkező végletet az egysejtűek csillói és flagellái jelentik, amelyek a hullámforma, az ütésfrekvencia és az effektív löketorientáció gyors változásaira támaszkodnak, hogy reagáljanak a környezeti jelzésekre. Ezekben az organellákban a CP csavarodott, így nem tartanak fix orientációt az alaptól a csúcsig a környező 9 kettősön belül. Ráadásul ezek a csavart CP-k a kanyarulat terjedése során forognak (Omoto et al., 1999). Nemrégiben kimutattuk, hogy a Chlamydomonas CP minden kanyarban a kanyar síkjával párhuzamosan orientálódik (1D ábra), és 180°-kal elfordul az egymást követő fő- és fordított kanyarok között, és hogy a C1 mikrotubulus mindig az egyes kanyarok külső oldalán lévő doubletekhez van a legközelebb (Mitchell, 2003b). A CP-nek ez az állandó orientációja egy kanyarhoz képest a Chlamydomonasban lehetővé teszi, hogy a CP-projekciók egyik csoportja aktív dyneinekkel rendelkező kettősökhöz kapcsolódó radiális küllőkkel lépjen kölcsönhatásba, míg a CP-projekciók másik csoportja inaktív dyneinekkel rendelkező kettősök radiális küllőkkel lép kölcsönhatásba.
Az ütemburkolat a Chlamydomonasban közel sík, és a fő kanyarok iránya nem változik drámaian az állandó síkból, ez azonban más organizmusokra nem igaz. Ha a CP orientációja ezekben a többi organizmusban is követi a kanyarok orientációját, ahogy én javaslom, akkor a CP mindig úgy helyezkedik el, hogy rugalmas motilitásvezérlést biztosítson. A legújabb eredményeink azt mutatják, hogy a CP orientációja passzívan igazodik a Chlamydomonas flagellum alapjainál kialakuló kanyarokhoz, majd ez a kanyarfüggő orientáció áthelyeződik, ahogy az egyes kanyarok az alaptól a csúcs felé terjednek. Egy mérnöki analógia a csigakerék, amelyben a csiga (központi pár) forgása a fogazott fogaskerék (axonemális kanyarok) egymásba illeszkedő fogaskerekeinek merőleges mozgásához (kanyarulat terjedéséhez) van kötve. A fő kanyar irányát tehát nem a központi pár orientációja határozhatja meg, amely passzívan igazodik a kanyarokhoz, hanem a külső kettősök szintjén kell szabályozni, a flagelláris bázison lévő iniciációs mintázatokon keresztül. A CP-ből érkező szabályozó jelek ezután meghatározhatják az alakot és a lüktetési frekvenciát a dynein aktivitási mintázatok közvetlen modulációján keresztül a fejlődő és terjedő kanyarokban. Ez a hipotézis összhangban van a tengeri sün axonémák verési síkjának rezgési átorientációjával kapcsolatos eredményekkel (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Ha a rezgés által indukált új hajlítási sík a központi pár új orientációját kényszeríti ki, akkor a rendszer relaxációja a ráerőltetett rezgés eltávolítása után ezekből a sejtekből a központi pár fokozatos visszaforgatását igényelné a nyugalmi helyzetbe. Sajnos ezekben a kísérletekben nem kaptunk információt a CP tényleges orientációjáról. Ez a hipotézis összhangban van a proteázzal kezelt Chlamydomonas axonémákban megfigyelt kettőscsúszás mintázatával is, amelyben a kettőscsúszás mintázata állandó kapcsolatot tart fenn a központi pár orientációjával (Wargo és Smith, 2003; Wargo et al, 2004, valamint a dynein aktivitásának vizsgálatával a Chlamydomonas (Smith, 2002) és a tengeri sün (Yoshimura és Shingyoji, 1999; Nakano és mtsai., 2003) axonemekben, amelyek kalcium- és központi párfüggő aktivitás-modulációt mutatnak.
Milyen előrejelző értékkel bírnak ezek a spekulációk a csillók és flagellák evolúciójával kapcsolatban? Először is, feltételezzük, hogy a flagellák felszíni mozgékonyságának fejlődése primitív, és valószínűleg széles körben találkozunk vele, még a nem verdeső csillószármazékokban is. Az IFT nyilvánvalóan alapvető és univerzális motilitás mind a mozgékony, mind a nem mozgékony organellumok összeszereléséhez, így ennek a gépezetnek az extracelluláris mozgáshoz való kapcsolódása ugyanilyen széles körben elterjedt lehet. Másodszor, a receptorok szekvenálása a csillómembránokon szintén primitív, és valószínűleg a nem-motilis primer csillók, valamint az érzékszervek magasabban módosított csillói fennmaradásának egyik fő szelekciós nyomása. Mivel a csillószármazékok számos élőlény érzékszervi neuronjaiban alapvető funkciókat látnak el, csak egy kis képzeletbeli ugrás szükséges ahhoz, hogy feltételezzük, hogy a protocilium is az összes érzékszervi folyamat ősi platformját képezte, és hogy ennek az organellának további jellemzői közösek lehetnek az érzékszervi transzdukciós kaszkádokban. Harmadszor, a centroszóma orientációja, mint a sejtpolaritás és a mozgékony sejtek vándorlási irányának jelzője, szintén nagyon primitív. Ha ez így van, akkor a protocilium mint a sejtpolaritás és az irányított migráció korai meghatározójának fontossága arra utal, hogy további kapcsolatokat kell keresni a sejtpolaritást meghatározó mechanizmusok és a centroszómák/centriolák orientációját a citoplazmatikus mikrotubulusok tömbjével együtt meghatározó mechanizmusok között. Végül, a csillók és a flagellák centrópár általi szabályozásának szintén nagyon korán ki kellett alakulnia az eukarióta evolúcióban, még az összes ma élő eukarióta törzs sugárzása előtt. Bár kétségtelenül léteznek különbségek az ezen organellumok által megkövetelt részletes szabályozásban a különböző organizmusokban és sejttípusokban, arra kell számítanunk, hogy sok univerzális vonást találunk abban, ahogyan a központi pár-radialis küllők kölcsönhatásai szabályozzák a dynein aktivitást, és talán még közös témákat találunk az axonemális és citoplazmatikus dynein motorok szabályozásában.