PMC

Reprezentatív eredmények

A plakkvizsgálatok vírustiterek pontos meghatározására való képessége számos tényezőtől függ: a megfelelő gazdasejt kiválasztás, a sejtek és vírusok életképességét biztosító megfelelő közeg és növekedési feltételek, az immobilizált vírusszaporítás, valamint a vírus inkubációs idejének pontos meghatározása, hogy elegendő idő álljon rendelkezésre a különálló és megszámlálható plakkok kialakulásához.

Ezért a vizsgálatért három reprezentatív családból származó vírusokat választottunk ki, hogy bemutassuk a következő különbségeket: fedősejt-szelekció, inkubációs időszakok és plakkmorfológia a különböző mintatípusok között. A venezuelai ló-encephalitis (VEEV) vírust választottuk (+)ssRNS vírusmodellnek, amely jelentős betegséget okozhat lófélékben és emberekben, és a Togaviridae családot képviseli. Az influenza B tajvani törzs, egy szegmentált (-)ssRNS-vírus, amely elsősorban az embert fertőzi, és az Orthomyxoviridae családot képviseli. A Rift-völgyi láz vírus (RVFV), egy ízeltlábúakból származó (-)ssRNS vírus, amely elsősorban ízeltlábúakat, kérődzőket és embert fertőz, a Bunyaviridae család képviselőjeként került kiválasztásra.

Az RVFV esetében (1. ábra) a titereket az RVFV rekombináns, élő, attenuált MP12 törzsének törzsoldatából határozták meg 12 lyukú lemez formátumban, CMC, agaróz vagy Avicel fedőlemezek felhasználásával, amelyeket egymás mellett inkubáltak 72 órán keresztül a fertőzést követően (hpi). Egy reprezentatív lemez, amely 10-4 és 10-7 közötti hígításokat mutat, az A panelben látható. A CMC- és agaróz-felületet használó plakkok kis, tiszta és jól elkülönülő plakkokat mutattak, jól meghatározott kör alakú határral. A folyadékkal fedett plakkok az agaróz- és CMC-plakkokhoz képest kissé nagyobbak és nagyobbak voltak, és kevésbé határozott határt biztosítottak. A vírustitereket a B panelben hasonlítottuk össze, ahol az összes fedőlemez összehasonlíthatóan teljesített.

Az MP12-re vonatkozó fedőlemezek közötti egyértelműbb vizuális összehasonlítás érdekében, valamint a reprodukálhatóság meghatározásához szükséges nagyobb mintanagyság érdekében egy 6 lyukú lemezt is kipróbáltunk három példányban (2. ábra). A 6 lyukú lemezformátumban a CMC-felület használata kisebb plakkokat mutatott, mint az agaróz vagy a folyékony felületek, amelyek mérete összehasonlítható volt egymással. Míg a vírustiterek mindhárom fedőréteg között hasonlóak voltak (D. panel), az agaróz és a folyékony fedőrétegben kialakult plakkokat könnyebbnek bizonyult megszámolni a nagyobb méretük miatt.

Az RVFV-vel ellentétben a VEEV-titerek és a plakkok morfológiája a különböző fedőrétegek között jelentősen különbözött (3A. ábra). A CMC-felületeken képződött plakkok egyértelmű és határozott morfológiát mutattak, amikor 12 lyukú lemezformátumot használtak, a plakkok méretének és érzékenységének rovására (B panel). A CMC-vel ellentétben az agaróz és a folyékony fedőlemezek használata jelentősen nagyobb plakkokat eredményezett, ami alacsonyabb vírusgátlásra és a VEEV-replikációval szembeni fokozott érzékenységre utal. Ezt korábban megerősítették, amikor kizárólag az agarózt és a CMC-t hasonlították össze a Juarez és munkatársai által publikált tanulmányban4. Míg az agaróz és a folyékony fedőrétegek nagyobb plakkokat eredményeztek, mint a CMC, a plakkok határai rosszul definiáltak voltak, és nehéz volt megszámolni őket a 12 lyukú formátumban, a folyékony fedőrétegek pedig a legnagyobb határdiffúziót biztosították. Amikor a plakkokat 6 lyukú lemezeken próbálták ki (4. ábra), a nagyobb 6 lyukú formátum elhárította a nyíltan nagy plakkok problémáját, amelyeket nehéz volt megkülönböztetni a 12 lyukú formátumban, az agaróz és a folyékony fedések pedig jobbnak bizonyultak a CMC fedéseknél a plakkok meghatározása és érzékenysége szempontjából (4D ábra).

Az RVFV-vel vagy a VEEV-vel összehasonlítva az influenza számos egyedi kihívást jelent a plakkozás során, például külső proteáz szükségességét. Az influenzavírus érzékenységét a különböző fedőanyag-választásokra a múltban is jól dokumentálták, mivel jelentős változásokat észleltek, amikor olyan apró módosításokat alkalmaztak, mint az agaróz különböző márkái9.

Az influenza B tajvani törzs esetében érdekes módon a CMC fedőanyagként való használata jelentősen kisebb plakkokat eredményezett, amelyeket nehéz volt megszámolni és nehéznek bizonyult megbízhatóan pontozni (5A. ábra). Az agaróz fedőréteg használata adta a legjobb plakkokat (C panel), és sötétebb háttérfestést eredményezett (valószínűleg a megnövekedett monoréteg életképességének köszönhetően), valamint tisztább és élesebb plakkokat mutatott közvetlen összehasonlításban a folyékony fedőréteg használatával (B panel).

A folyékony polimerek egyértelmű előnye a szilárd és félszilárd fedőrétegekkel, például agarózzal és CMC-vel szemben a könnyű eltávolíthatóságban és alkalmazásban rejlik. A félszilárd fedőrétegek melegítést igényelnek, és a megszilárdulás problémásnak bizonyulhat a kezelés és eltávolítás során. Ezen előnyök kihasználása és az Avicel nagy áteresztőképességű RVFV-hez történő felhasználásának gyakorlati megvalósíthatóságának meghatározása érdekében 96 lyukú lemezformátumot próbáltunk ki különböző fedőanyag-koncentrációkkal (6. ábra). Az RVFV MP-12 esetében a hígításokat négyszeresére végeztük mind 0,6, mind 1,2%-os végső Avicel-koncentrációval. Az átfedés felhordása és eltávolítása egyszerűnek bizonyult, és sem az ismétlések között, sem a koncentrációk között nem észleltek nyilvánvaló különbségeket, ami a nagyfokú reprodukálhatóságot bizonyítja. A pontozás során a plakkok szabad szemmel is jól elkülöníthetőek és megszámlálhatóak voltak, ami bizonyítja a folyékony fedőrétegek nagy áteresztőképességű felhasználásának megvalósíthatóságát az RVFV esetében.

1. ábra: RVFV plakkok fedőrétegének összehasonlítása 12 lyukú lemezek felhasználásával. Veros sejteket 2,5 x 105 sejtet telepítettünk 12 lyukú lemezekbe, és 200 µl-rel fertőztük meg az MP12 azonos sorozatosan hígított kiindulási mintájával. A fertőzést követően 1,5 ml 0,3%-os agaróz, 0,6%-os Avicel vagy 1%-os CMC (végső koncentráció) fedőlemezt alkalmaztunk, hogy közvetlenül összehasonlíthassuk a fedőlemezeket, amint azt az A. panel mutatja. A B. panelben megszámoltuk és titereltük a plakkokat.

2. ábra:RVFV plakkok fedőlemezes összehasonlítása 6 lyukú lemezek felhasználásával. A Veros sejteket 5 x 105 sejtben telepítettük 6 lyukú lemezekbe, és 400 µl-rel fertőztük meg az MP12 azonos sorozatosan hígított kiindulási mintájával. Három ml 0,3%-os agarózzal, 0,6%-os Avicellel vagy 1%-os CMC-vel történő fedést alkalmaztunk az A, B és C panelben bemutatott fedések közvetlen összehasonlítása érdekében. Külön kísérleteket végeztünk az A-C paneleknél leírtakkal azonos módon, a D panelben a plakkok megszámlálásával és titerelésével (N = 3).

3. ábra:VEEV plakkok fedésének összehasonlítása 12 lyukú lemezek felhasználásával. A verókat 2,5 x 105 sejtet telepítettünk 12 lyukú lemezekbe, és 200 µl-rel fertőztük meg a VEEV TC-83 vakcinatörzs azonos sorozatosan hígított kiindulási mintájával. A fertőzést követően 1,5 ml 0,3%-os agarózzal, 0,6%-os Avicellel vagy 1%-os CMC-vel történő átfedést alkalmaztunk, hogy közvetlenül összehasonlíthassuk az átfedéseket, amint azt az A panel mutatja. A Veros sejteket 5 x 105 sejtben ültettük 6 lyukú lemezekbe, és 400 µl-rel fertőztük meg a VEEV TC-83 azonos sorozatosan hígított kiindulási mintájával. A fertőzést követően 3 ml 0,3%-os agarózzal, 0,6%-os Avicellel vagy 1%-os CMC-vel történő átfedést alkalmaztunk az átfedések közvetlen összehasonlítása érdekében, amint azt az A, B és C panelek mutatják. Külön kísérleteket végeztünk az A – C paneleknél leírtakkal azonos módon, a D panelben (N = 3) a plakkok megszámlálásával és titerelésével.

5. ábra: Influenza plakkok átfedésének összehasonlítása. Az MDCK-sejteket 5 x 105 sejtet telepítettünk 6 lyukú lemezekbe, és 400 µl inokulummal fertőztük meg ugyanazt a sorozatosan hígított kiindulási mintát használva a tajvani influenza B-ből. Nem használtunk magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a növekedési táptalajban vagy az átfedésekben, mivel az FBS gátolhatja az influenza szaporodását bizonyos proteázok gátlásán keresztül, amelyek szükségesek a vírusfúzióhoz. A vírus fúziójának és a gazdasejtekbe való bejutásának elősegítése érdekében a felhordás előtt valamennyi fedőanyaghoz TPCK-tripszint adtunk. A fertőzés után 3 ml 0,3%-os agaróz, 0,6%-os Avicel vagy 1%-os CMC fedőanyagot alkalmaztunk a fedőanyagok közvetlen összehasonlítása érdekében, amint azt az A , B és C panel mutatja. Külön kísérleteket végeztünk az A-C panelekben leírtakkal azonos módon, a D panelben a plakkok megszámlálásával és titerelésével (N = 3). Bár a CMC plakkok esetében átlagot vettünk, nehéznek bizonyult megbízhatóan megszámolni őket, mivel diffúz határokat és nagyon kis méretű plakkokat mutattak.

6. ábra: Nagy áteresztőképességű plakkok átfedései. Egy 96 lyukú Veros-lemezbe ültetett, lyukanként 3 x 104 sejtet tartalmazó Veros-lemezt 50 µl inokulummal fertőztünk meg az RVFV MP12 azonos, sorozatosan hígított kiindulási mintájával 1 órán keresztül, négyszeresével. Az átfedésekhez az Avicel 0,6 és 1,2%-os végső koncentrációját próbáltuk ki, hogy meghatározzuk a folyékony átfedések nagy áteresztőképességű felhasználásának megvalósíthatóságát és reprodukálhatóságát, A és B panel.

1. táblázat:Plaque Assay Beoltási feltételek és sejttípusok

Táblázat 2:Plaque és vírusos/sejtes növekedési médiumok

A fedőoldatok nem járnak le, ha elkészülnek, amíg a sterilitás megmarad.

3. táblázat: Overlay készlet

4. táblázat: Lemezformátumok

.