Az általános blotolási eljárás a teljes RNS homogenizált szövetmintából vagy sejtekből történő kivonásával kezdődik. Az eukarióta mRNS ezután oligo(dT)-cellulóz kromatográfiával izolálható, hogy csak a poli(A)-farokkal rendelkező RNS-eket izoláljuk. Az RNS-mintákat ezután gélelektroforézissel választják szét. Mivel a gélek törékenyek, és a szondák nem tudnak behatolni a mátrixba, az immár méret szerint elválasztott RNS-mintákat kapilláris vagy vákuumos blotting rendszeren keresztül nejlonmembránra viszik át.
Kapilláris blotting rendszer beállítása az RNS elektroforézis gélről blotting membránra történő átvitelére.
A pozitív töltésű nejlonmembrán a leghatékonyabb az északi blottinghoz, mivel a negatív töltésű nukleinsavak nagy affinitással rendelkeznek hozzá. A blottinghoz használt transzferpuffer általában formamidot tartalmaz, mivel ez csökkenti a szonda-RNS kölcsönhatás lágyulási hőmérsékletét, így nincs szükség magas hőmérsékletre, amely az RNS lebomlását okozhatná. Miután az RNS-t átvittük a membránra, UV-fény vagy hő hatására kovalens kötéssel immobilizáljuk a membránhoz. Miután a szondát megjelölték, azt a membránon lévő RNS-hez hibridizálják. A hibridizáció hatékonyságát és specificitását befolyásoló kísérleti körülmények közé tartozik az ionerősség, a viszkozitás, a duplex hossza, a nem illeszkedő bázispárok és a bázisösszetétel. A membránt mossuk, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a szonda specifikusan kötődött, és hogy megakadályozzuk a háttérjelek kialakulását. A hibrid jeleket ezután röntgenfilmmel detektálják, és denzitometriával számszerűsíthetők. Az északi blotban történő összehasonlításhoz kontrollok létrehozásához az érdeklődésre számot tartó génterméket nem mutató minták használhatók mikroarrays vagy RT-PCR általi meghatározás után.
GelsEdit
RNS fut formaldehid agaróz gélen a 28S (felső sáv) és 18S (alsó sáv) riboszómális alegységek kiemelésére.
Az RNS-mintákat leggyakrabban olyan agarózgéleken választják el, amelyek formaldehidet tartalmaznak az RNS denaturálószereként a másodlagos szerkezet korlátozása érdekében. A gélek etídium-bromiddal (EtBr) megfesthetők és UV-fényben megtekinthetők az RNS minőségének és mennyiségének megfigyelésére a blottolás előtt. A poliakrilamid gélelektroforézis karbamiddal szintén használható az RNS elválasztására, de leggyakrabban töredezett RNS vagy mikroRNS esetében alkalmazzák. A kapott fragmentumok méretének megfigyelésére gyakran egy RNS létrát futtatnak a minták mellett az elektroforézis gélen, de a teljes RNS mintákban a riboszómális alegységek méretjelzőként szolgálhatnak. Mivel a nagy riboszómális alegység 28S (kb. 5 kb) és a kis riboszómális alegység 18S (kb. 2 kb), két markáns sáv jelenik meg a gélen, a nagyobbik közel kétszer olyan intenzitással, mint a kisebbik.
SzondákSzerkesztés
A northern blottinghoz használt szondák olyan nukleinsavakból állnak, amelyek komplementer szekvenciája az érdeklődésre számot tartó RNS egészére vagy egy részére vonatkozik, ezek lehetnek DNS, RNS vagy oligonukleotidok, amelyek legalább 25 komplementer bázissal rendelkeznek a célszekvenciához képest. Az in vitro átírt RNS-szondák (riboszondák) képesek ellenállni a szigorúbb mosási lépéseknek, megelőzve a háttérzaj egy részét. Általában cDNS-t állítanak elő a kívánt RNS-szekvenciához jelölt primerekkel, hogy az északi blotban szondaként szolgáljon. A szondákat vagy radioaktív izotópokkal (32P), vagy kemilumineszcenciával kell jelölni, amelyben az alkalikus foszfatáz vagy a torma-peroxidáz (HRP) lebontja a kemilumineszcens szubsztrátokat, ami kimutatható fénykibocsátást eredményez. A kemilumineszcens jelölés kétféleképpen történhet: vagy a szonda kötődik az enzimhez, vagy a szondát egy ligandummal (pl. biotin) jelöljük, amelyhez a ligandum (pl. avidin vagy streptavidin) az enzimhez (pl. HRP) kapcsolódik. A röntgenfilm mind a radioaktív, mind a kemilumineszcens jeleket képes detektálni, és sok kutató a kemilumineszcens jeleket részesíti előnyben, mivel ezek gyorsabbak, érzékenyebbek, és csökkentik a radioaktív jelölésekkel járó egészségügyi kockázatokat. Ugyanazt a membránt akár ötször is meg lehet vizsgálni anélkül, hogy a cél-RNS jelentős mértékben elveszne.