Hogyan működik az ioncserélő kromatográfia?

Az ioncserélő (IEX) kromatográfia egy olyan technika, amelyet gyakran alkalmaznak a biomolekulák tisztításában. A molekuláknak a töltésük alapján történő elválasztását jelenti.

Ez a technika kihasználja a mintában lévő töltött molekulák és a kromatográfiás mátrix állófázisában lévő ellentétesen töltött részek közötti kölcsönhatást. Ez a fajta elválasztás más technikákkal nehézkes, mivel a töltés könnyen manipulálható az alkalmazott puffer pH-jával.

Az ioncserés elválasztásnak két típusa lehetséges – a kationcsere és az anioncsere. Az anioncserénél az állófázis pozitív töltésű, míg a kationcserénél negatív töltésű.

Az ioncserélő kromatográfia elve

Az ioncserélő kromatográfiát töltött biomolekulák elválasztására használják. A töltött molekulákat tartalmazó nyers mintát folyadékfázisként használják. A kromatográfiás oszlopon áthaladva a molekulák az állófázis ellentétes töltésű helyeihez kötődnek.

A töltésük alapján elválasztott molekulákat változó ionerősségű oldattal eluálják. Az ilyen oldat oszlopon való áthaladásával a molekulák nagymértékben szelektív elválasztása történik a különböző töltéseik alapján.

A technika

Az ioncserélő kromatográfiás eljárás legfontosabb lépései az alábbiak:

• A tisztátalan fehérjemintát egy adott pH-n az ioncserélő kromatográfiás oszlopba töltik.
• A feltöltött fehérjék a gyanta ellentétesen töltött funkciós csoportjaihoz kötődnek
• A szeparált fehérjék eluálására sógradienst használnak. Alacsony sókoncentrációnál kevés töltött csoporttal rendelkező fehérjék eluálódnak, magasabb sókoncentrációnál pedig több töltött csoporttal rendelkező fehérjék eluálódnak.
• A nem kívánt fehérjéket és szennyeződéseket az oszlop mosásával távolítják el.

A pH-gradiens alkalmazható az egyes fehérjék eluálására is izoelektromos pontjuk (pI) alapján, azaz azon a ponton, ahol a fehérje aminosavai semleges töltéssel rendelkeznek, és ezért elektromos térben nem vándorolnak. Mivel az aminosavak zwitteres ionos vegyületek, pozitív és negatív töltéssel rendelkező csoportokat egyaránt tartalmaznak. A környezet pH-értéke alapján a fehérjék pozitív, negatív vagy nulla töltést hordoznak. Izoelektromos pontjukon nem lépnek kölcsönhatásba az oszlopgyanta töltött részeivel, ezért eluálódnak. Csökkenő pH-gradiens használható a fehérjék eluálásához anioncserélő gyantával, és növekvő pH-gradiens használható a fehérjék eluálásához kationcserélő gyantával. Ennek oka, hogy a mozgófázis puffer pH-értékének növelésével a fehérje kevésbé protonálódik (kevésbé pozitív töltésű), így nem tud ionos kölcsönhatást kialakítani a negatív töltésű gyantával, ami lehetővé teszi az eluálást. Ezzel szemben a mozgófázis pH-értékének csökkentése a molekula protonáltabbá (kevésbé negatívan töltötté_ válik, lehetővé téve az elúcióját.

A gyanták kiválasztása az ioncserés kromatográfiában

Az ioncserélő gyanták pozitív vagy negatív töltésű funkcionális csoportokkal rendelkeznek, amelyek kovalensen kapcsolódnak egy szilárd mátrixhoz. A mátrixok általában cellulózból, polisztirolból, agarózból és poliakrilamidból készülnek. A gyanta kiválasztását befolyásoló tényezők közül néhány tényező az anion- vagy kationcserélő, az áramlási sebesség, a gyenge vagy erős ioncserélő, a gyanta részecskemérete és a kötési kapacitás. Az érdeklődésre számot tartó fehérje stabilitása diktálja az anion- vagy kationcserélő kiválasztását – bármelyik cserélő használható, ha a stabilitás nem okoz gondot.

Az ioncserés kromatográfia alkalmazásai

Az ioncsere a legszélesebb körben használt kromatográfiás módszer a töltött biomolekulák, például polipeptidek, fehérjék, polinukleotidok és nukleinsavak elválasztására és tisztítására. Széleskörű alkalmazhatósága, nagy kapacitása és egyszerűsége, valamint nagy felbontóképessége az elválasztási módszer sikerének fő okai. Az ioncserélő kromatográfiát széles körben használják számos ipari alkalmazásban, amelyek közül néhány a következő:

• Vérkomponensek, például albumin, rekombináns növekedési faktorok és enzimek elválasztása és tisztítása.
• Biotechnológia – Analitikai alkalmazások, mint például a minőségellenőrzés és a folyamatok nyomon követése
• Élelmiszeripari és klinikai kutatás – a búzafajták és a proteinuria különböző vesebetegségekkel való összefüggésének tanulmányozására.
• Fermentáció – A kationcserélő gyantákat a ß-galaktozidáz előállítása során a fermentációs folyamat nyomon követésére használják.

További olvasmányok

• Minden kromatográfiás tartalom
• Kromatográfia áttekintése
• Gázkromatográfia-Masszaspektrometria (GC-MS) alkalmazások
• Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC)
• Folyadékkromatográfia-Tömegspektrometria (LC-MS) alkalmazások

Citációk