Kezdeti problémákSzerkesztés
TermolabilitásSzerkesztés
Az FLP-FRT rekombináz kezdeti alkalmazása nem működött emlősökben. Az FLP fehérje termolabilis volt (megemelt hőmérsékleten denaturálódik), ezért nem volt használható az emlős modellben e modellrendszerek megemelt testhőmérséklete miatt. A Cre-Lox rekombináció használatára vonatkozó szabadalmak és korlátozások miatt azonban nagy figyelmet fordítottak egy termostabilabb FLP-FRT kazetta előállítására. Az első eredmények közül néhányat Buchholz és munkatársai (1997) produkáltak ciklikus mutagenezis alkalmazásával Escherichia coli-ban. Kutatásukban a szerzők E. coli sejteket transzfektáltak két plazmiddal: az egyik véletlenszerűen mutált FLP fehérjéket kódolt egy arabinóz promóter után, a másik pedig egy lacZ gén promótert tartalmazott egy FRT kazettán belül. Az E. coli-kat arabinózlemezeken 37 °C-on és 40 °C-on növesztették, és ha rekombináció történt, a lacZ expresszió gyengült, és a telepek fehérnek tűntek. A fehér kolóniákat minden generációból kiválogattuk, és új arabinózlemezeken növesztettük ugyanolyan korábbi hőmérsékleten nyolc generáción keresztül. Miután a rekombinációt western-blottinggal megerősítették, és a mutált FLP-géneket szekvenálták, ezt a nyolcadik generációs FLP-fehérjét (FLPe) emlős sejtkultúrába transzfektálták, és a rekombinációt emlős sejtekben megerősítették. Az FLP e változata csak 4 aminosavcserét tartalmaz: P2S, L33S, Y108N és S294P.
Genetikai mozaikok generálásaSzerkesztés
A genetikai mozaikosság egy szervezeten belül akkor fordul elő, amikor hasonló sejttípusok különböző fenotípusokat fejeznek ki a specifikus lókuszok eltérő genotípusai miatt. Egyszerűen fogalmazva, ez akkor következik be, amikor egy szervezetben különböző genotípusok találhatók, ami általában ritka a természetben. Ez azonban könnyen (és problémásan) előállítható FLP-FRT rekombinációval. Ha egy sejtben két különböző FRT-hely van jelen, és az FLP megfelelő koncentrációban van jelen, akkor az FRT-kazetta továbbra is kivágódik és beilleszkedik a két FRT-hely közé. Ez a folyamat addig folytatódik, amíg az FLP-fehérjék koncentrációja a szükséges koncentráció alá nem csökken, ami azt eredményezi, hogy a szervezeten belüli sejtek különböző genotípusokkal rendelkeznek. Ez a gyümölcslegyektől az egerekig megfigyelhető, és megkülönböztetés nélkül működik specifikus kromoszómákkal (szomatikus és nemi) vagy sejttípusokkal (szomatikus és csíravonal) szemben.
Sejtvonalak meghatározásaSzerkesztés
A Dymecki és munkatársai (1998) publikációja előtt a Cre rekombinázt a neuronális progenitorok sejtsorsának feltérképezésére használták egerekben az En2 promóter segítségével. Így a Dymecki és munkatársai (1998) szerzői azt feltételezték, hogy az FLP-rekombináz hasonló módon, a Cre-rekombinázhoz hasonló hatékonysággal használható egerekben. A szerzők két transzgenikus egérvonalat hoztak létre: egy neuronális Wnt1::Flp fúziós vonalat és egy olyan vonalat, amely a tm1Cwr 18. exonját flankáló FRT kazettával rendelkezett. A szerzők azért választották ezt az exont kivágásra, mert ha kivágják, az null fenotípust eredményez. A szerzők a két vonalat párosították, és hagyták, hogy az utódok elérjék a felnőttkort, mielőtt az utódokat feláldozták. Az RNS extrakciót neuronális, izom-, bél- és farokszövetből végezték. A fordított transzkripciós PCR és az északi blotting megerősítette a tm1Cwr 18. exonjának kivágását az agyszövetben bőségesen, az izomszövetben pedig mérsékelten (az izomban lévő Scwhann-sejtek miatt). A várakozásoknak megfelelően más szövetekben nem volt kimutatható a kivágás. A szerzők az FLP rekombináznak a Cre rekombinázzal azonos, ha nem jobb hatékonyságát látták a sejtsorsmeghatározásban.
Drosophila melanogasterben (gyümölcslégy)Edit
Az Flp rekombinázt eddig számos alkalommal használták D. melanogasterben. A Flp rekombináz és a Cre rekombináz összehasonlítását D. melanogasterben Frickenhaus és munkatársai (2015) publikálták. A Frickenhaus et al. (2015) szerzőinek kettős célja volt: jellemezni és összehasonlítani az Flp rekombináz “knock-out” hatékonyságát a Cre rekombináz “knock-out” és az RNAi knockdown hatásával, valamint feltárni a cabeza (caz), a FUS légy ortológja, funkcióját a D. melanogaster neuronjaiban és izomszövetében. A FUS erősen érintett az amyotrófiás laterálszklerózisban (ALS) és az emberi frontotemporális demenciában . A szerzők elav-Gal4/UAS-Flp vagy Cre rendszert használtak a rekombináz specifikus expressziójára az idegsejtekben és Mef2-Gal4/UAS-Flp vagy Cre rendszert a specifikus expressziójára az izmokban. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy az Flp rekombináz “knock-out” eszköz hatékonyabb, mint az RNAi és a Cre rekombináz, ha specifikus gének kiütéséről van szó specifikus szövetekben vagy sejtvonalakban, mivel hiányzik a Cre fehérje és az RNAi átirat esetében is megfigyelhető szivárgó expresszió. Emellett a szerzők a Cre fehérje toxicitását is megfigyelték, ami az Flp fehérje esetében nem tapasztalható.
Danio rerio (Zebrahal)Edit
Az FLPe rekombináz rendszer hatékonyságát Wong és munkatársai (2009) értékelték zebrahalakban. Olyan embriókba, amelyek hemizigóta voltak egy izomspecifikus promóter után elhelyezkedő, FRT-vel szegélyezett, megerősített zöld fluoreszcens fehérje (EGFP) számára, befecskendezték az FLPe fehérjét. FLPe nélkül ezeknek az embrióknak minden izomszövetben EGFP-t kell expresszálniuk, és ha vad típusú szálakkal keresztezik őket, a keletkező utódok 50%-ának szintén EGFP-t kell expresszálnia az izomszövetben. Az FLPe-vel injektált embrióknál jelentősen csökkent az EGFP expressziója az izomszövetben, és mozaikosság is megfigyelhető volt. Amikor ezek az embriók elérték a felnőttkort, vad típusú törzzsel párosították őket, és az így kapott fészekaljakban lényegesen kevesebb olyan utód volt, amely az izomszövetben kifejezte az EGFP-t (0-4%). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az FLPe nemcsak a szomatikus sejtekben, hanem a zebrahalak csíravonalában is rendkívül hatékony,
NövényekbenSzerkesztés
“Fitoszenzorok” vagy “őrszemek” létrehozása Arabidopsis thaliana és Tobacco növényekbenSzerkesztés
A fitoszenzorok olyan genetikailag módosított növények, amelyek képesek jelezni a biotikus vagy abiotikus szennyeződések jelenlétét. Nyilvánvaló, hogy ezeknek a módosított növényeknek a termesztése nagy mezőgazdasági és laboratóriumi ígéretekkel bír. A megfelelő riportvektor létrehozása azonban problémásnak bizonyult. cisz-szabályozó elemek nagy szerepet játszanak a növényekben a gének transzkripciós aktiválásában, és sokuk nem jól ismert. Sok fitoszenzor vagy alul expresszálja a riporter géneket, vagy a szintetikus promóterek miatt hamis pozitív eredményt ad. Rao és munkatársai (2010) szerzői az FLP rekombináz eszközt használták egy nagy hatékonyságú fitoszenzor előállítására. A szerzők hősokk-promótert használtak az FLP termelésének indukálásához, míg egy FRT-flankolt vektor elválasztotta a CaMV 35S promótert a béta-glükuronidáz géntől (GUS). Amikor a növényeket hősokknak tették ki, az FLP-indukció az FRT-flankolt vektor kivágásához vezetett, így a GUS gén ténylegesen közvetlenül a CaMV 35S promóter utánra került. A GUS aktiválódása azt eredményezte, hogy a növények levelei zöldről kékre változtak; így a fitoszenzor hatékonyan jelentette a stresszt a modellrendszer számára!
Cre-rekombinázzalEdit
A gate-way-ready indukálható MiRNS (GRIM) expressziós rendszer előállításaEdit
Az RNS interferencia (RNAi) paradigmaváltást okozott a gének expressziójában és a lehetséges génkiütésekben az Eukariótákban. A GRIM expressziós rendszer előállítása előtt az RNAi vektorok előállítása költséges és időigényes volt. A vektorokat a hagyományos copy-and-paste molekuláris klónozási módszerrel állították elő. Garwick-Coppens és munkatársai (2011) egy sokkal hatékonyabb módszert dolgoztak ki az RNSi vektorok előállítására, amelyben az RNSi expressziója Cre-rekombinázzal kopogtatható be, és Flp-rekombinázzal kopogtatható ki. Az új GRIM expressziós rendszer lehetővé teszi a mesterséges RNAi-konstrukciókat tartalmazó expressziós vektorok sokkal gyorsabb előállítását. A szerzők a továbbiakban bemutatták, hogy expressziós rendszerük igen hatékonyan működik humán embrionális vesesejtekben (HEK), amely a molekuláris kutatásokban elterjedt humán immortalizált sejtvonal.