FFPE minták – Humán szövetminták előkészítése – Lab-Ally

Tartalomjegyzék

Bevezetés |Szövetbeszerzés |FFPE szövetek feldolgozása |Szelektálás |Hivatkozások

Ha kutatásaihoz FFPE mintákra vagy más humán biológiai mintákra van szüksége, kérjük, lépjen kapcsolatba velünk.

Bevezetés

A mai kutatók közül sokan szívesebben használnak FFPE szövetmintákat IHC, szövettani vagy in-situ genomikai elemzéseikhez. Az FFPE a “Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” (formalinnal fixált, paraffinba ágyazott) kifejezés rövidítése, és a szövetek tartósításának e módszerének két fő jellemzőjét írja le. A formalin egy formaldehid oldat, és azóta használják, hogy Ferdinand Blum német orvos az 1800-as évek végén felfedezte a formaldehid konzerváló hatását (Fox, et al., 1985). A paraffint a formaldehiddel történő rögzítést követően a szövetbe infúzióval juttatják, és a szövetet egy paraffinburkolattal is körülveszik, hogy segítsen a szövetet megtámasztani és megvédje az oxidációtól. A szakszerűen rögzített és beágyazott FFPE minták és a bennük lévő biomolekulák környezeti hőmérsékleten meglehetősen stabilak. A rögzített és beágyazott szövetek szerkezetileg rugalmasak, és szinte korlátlan ideig használhatók mikroszkópos anatómiai vizsgálatokra, de idővel néhány fehérje antigénje lebomlik, ami az IHC-vizsgálatokat néhány évtizednél nem régebbi mintákra korlátozza. A kettős szálú DNS meglepően stabil az FFPE blokkokban, de más, kevésbé stabil biomolekulák, például az RNS egy évtizeden belül vagy annál rövidebb idő alatt lebomolhatnak, különösen a metszetek vágása után.

A nagyszámú FFPE-mintát felhalmozó archívumok különösen gazdag adatforrást jelentenek, ha sok eset (azaz több donortól származó FFPE-minták) összehasonlítása kívánatos annak érdekében, hogy statisztikailag megbízható következtetéseket lehessen levonni az egyes indikációk jellemzőiről. Ha az FFPE-mintákat “nagy téttel bíró” orvosbiológiai kutatásokban kívánják felhasználni, akkor fontos, hogy az előkészítési folyamat minden szakaszát teljes körűen képzett és tanúsított szakemberek végezzék, lehetőleg CLIA tanúsítvánnyal rendelkező (azaz kormány által ellenőrzött) vagy CAP akkreditált (College of American Pathologists) laboratóriumban.

Meg kell jegyezni, hogy az FFPE-folyamat nem általánosan szabványosított, és az intézmények világszerte kissé eltérő protokollokat alkalmazhatnak különböző formalinoldatokkal, vagy más módon a saját preferenciáikhoz és követelményeikhez igazíthatják a folyamatot. A következőkben áttekintjük a folyamatot, és leírjuk, hogy az egyes lépések mivel járnak, valamint ismertetünk néhány gyakori variációt.

Szövetbeszerzés

A szövetfeldolgozást megelőzően szükséges a szövetbeszerzés lépése. Valójában ez a legnehezebben ellenőrizhető elem, mivel összefonódik a betegellátással, a 41CFR46-nak való megfeleléssel és az USA-ban a belső felülvizsgálati bizottság (IRB) felügyeletével. Az orvosi eljárás sajátosságai és a standard ellátás konvenciói azért fontosak, mert befolyásolhatják az olyan változókat, mint az érzéstelenítés beadása és az erek lekötése, a szövet eltávolítása és a rögzítés előtt eltelt idő, amelyek mindegyike hatással lehet a minta minőségére. Például az RNS és a fehérjék változásai valószínűleg a vérellátás lekötése és a szövet eltávolítása közötti időintervallum, az úgynevezett meleg iszkémiás idő alatt következnek be (Dash, et al., 2002). Ez az iszkémiás idő percektől órákig terjedhet a szervtől, az intézmény szabványos működési eljárásaitól, a sebésztől és más érintett egészségügyi dolgozóktól, valamint a sebészeti megközelítéstől függően. Ezért javasolt, hogy ezt az időt minden egyes mintára vonatkozóan rögzítsék, és a lehető legkisebbre csökkentsék (Hewitt, et al., 2008).

FFPE szövetfeldolgozás

A szövetminta megszerzése után további triázsra, boncolásra vagy mikrodissectióra (együttesen bruttózásnak nevezik) lehet szükség a szövet azon meghatározott részének elkülönítéséhez és előkészítéséhez, amelyet a további feldolgozási lépéseken átvezetnek. A szövetfeldolgozás ma már gyakran teljesen automatizált, egészen az utolsó lépésig, a beágyazásig, amely kézzel is elvégezhető. Sokféle szövetfeldolgozó áll rendelkezésre, de mindegyik a fent bemutatott első négy lépés sorrendjét követi. A különböző lépések automatizálása segít kiküszöbölni az eljárásbeli eltéréseket, mint a különböző FFPE-minták közötti kísérleti eredmények eltérésének forrását.

Fixálás

A fixálás az FFPE-szövetfeldolgozás első lépése. A figyelembe veendő kritikus tényezők közé tartozik az alkalmazandó oldat, a fixálás időtartamának hossza, valamint a fixálandó szövetminta vastagsága és szövettani tulajdonságai.

– Oldat

A legtöbb laboratórium által használt fixálószer a semleges pufferű, 10%-os formalin. A formalin egy olyan folyadék, amely 37-40% formaldehid és 10% metanol (tömegszázalékban) vízben; így a 10%-os formalin oldat körülbelül 3,7% – 4% formaldehidet és 1% metanolt tartalmaz (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). A valóságban a formaldehid oldatban elsősorban metilénglikol monomerek vagy kis polimerek formájában létezik (metándiol, formaldehid-monohidrát), amely a formaldehid vízzel való reverzibilis reakciója során keletkezik. A nagy tömegű metilénglikol-polimereket paraformaldehidnek nevezzük, és azok kicsapódnak az oldatból, de a metanol lelassítja ezt a polimerizációs folyamatot, ami az oka annak, hogy a formalinoldatokban szerepel. A vízzel hígított formalin (például 10%-os formalin) – és különösen, ha pufferoldatról van szó – elsősorban monomereket fog tartalmazni, mivel a nagyszámú vízmolekula felbontja azokat a metilénglikol-polimereket, amelyek normális esetben egy magasabb formaldehidkoncentrációjú oldatban léteznének (Kiernan, 2000). A formalin fennmaradó komponensét, a puffereket azért is adják hozzá, mert a formaldehid hajlamos hangyasavvá oxidálódni (Fox, et al., 1985). A hangyasav a szövetek rögzítésében a formalin pigment (savas hematin) szemcsék kicsapódását eredményezheti, amelyek hasonlíthatnak egyes paraziták által termelt pigmentekhez (Pizzolato, 1976). A formalin pufferelése megakadályozza ezt. Gyakori pufferanyagok a magnézium-karbonát, kalcium-karbonát, citrát, tris és foszfát pufferek (Hewitt, et. al., 2008). A kereskedelmi formalin gyakran tartalmaz foszfátpuffereket. A “semleges pufferű”, ami jellemzően a formalin előállításának módja, egyszerűen azt jelenti, hogy a pH-értéket 7 körül tartják.

– Folyamat és mechanizmus

A formaldehid és a metilénglikol alacsony molekulatömege miatt a formalin (elsősorban a metilénglikol oldatban) viszonylag gyorsan, a szövetek típusától függő, de átlagosan 1 mm/óra sebességgel hatol be a szövetekbe (Hewitt, et al., 2008). A rögzítési protokollok tehát attól függően változnak, hogy milyen típusú szövetet kívánnak rögzíteni. A szövet belsejében a formaldehidmolekulák oldatban lévő része elkezd keresztkötődni a fehérjékkel, de ez sokkal lassabban történik, mint a diffúzió sebessége. A formaldehid reakciója a szövetekkel kihúzza azt az oldatból, és visszahúzza ezt a reverzibilis formaldehid-metilénglikol reakciót a formaldehid irányába, így több keletkezik belőle, még ha el is fogy (Fox, et al., 1985). A lizin amino-oldalláncok a legreaktívabbak a formaldehiddel, de a formaldehiddel némileg reaktívak még az arginin, az aszparagin, a hisztidin, a glutamin, a szerin és a tirozin (Howat és Wilson, 2014). A reakciót követően a komplexhez kapcsolódó keletkező hidroxi-metilcsoport tovább reagálhat ugyanezzel a fehérjével vagy más fehérjékkel, így stabil metilénhidak (fehérje-CH2-fehérje) alakulnak ki (Kiernan, 2000). Ez okozza a formalinban fixált és így tartósított szövetek oldhatatlanságát és merevségét. Körülbelül 24-48 óra szükséges ahhoz, hogy ez a keresztkötés kellőképpen kialakuljon az egész szövetben (Thavarajah, et al., 2012), de javasolt, hogy erre a folyamatra legfeljebb 36 óra álljon rendelkezésre, mivel a hosszabb ideig tartó fixálás csökkenti az FFPE mintákban lévő biomolekulák minőségét, például a kivonható nukleinsavak hosszának csökkenésével (Hewitt, et al., 2012),

– Korlátozások

A formaldehid alkalmazásának legfőbb előnye – különösen a semleges pufferű, 10%-os formalin formájában -, hogy a szövetek és komponensek széles skáláját konzerválja. Vannak azonban korlátai is. Elektronmikroszkópiához például általában formaldehid és glutaraldehid (C5H8O2) kombinációját, vagy csak glutaraldehid oldatot használnak (Kiernan, 2000), mivel ezek az oldatok jobban megőrzik a szöveti struktúrákat erre a célra. Megjegyzendő, hogy a glutaraldehid vagy glutaraldehid-aldehid oldattal készített szövetek nem tekinthetők FFPE mintáknak. További kihívást jelent a DNS- és RNS-molekulák kinyerése az FFPE-szövetekből, mivel a formalin hajlamos módosítani a nukleinsavakat – akár olyan mértékben, hogy mesterséges mutációkat hoz létre a DNS-ben – és apró fragmentumokra bontani őket (Srinivasan, Sedmak és Jewell, 2002). Mégis lehetséges olyan DNS- és RNS-fragmentumok kivonása FFPE-szövetből, amelyek alkalmasak az elemzésre, ahogyan azt a Tang és munkatársai (2009) által írt protokoll leírja, a nukleinsav-kinyerés kulcstényezője pedig a megfelelő proteáz-emésztés. Az FFPE mintákból történő nukleinsavkivonáshoz kereskedelmi készletek is rendelkezésre állnak.

– A minta vastagsága

A formalinos fixálással kapcsolatos másik fontos szempont a szövetminta vastagsága. Bár a formalin viszonylag gyorsan behatol a szövetbe, mint már említettük, a szövet vastagsága befolyásolja a rögzített minta minőségét. Több időre van szükség ahhoz, hogy a formalin elérje a vastagabb szövetminták középpontját. Míg a formalin fokozatosan diffundál a minta legbelsőbb részeibe, a külső régiókban már megkezdődött a rögzítés folyamata, így az ott lévő biomolekulák nagyobb valószínűséggel bomlanak le a teljes rögzítéshez szükséges hosszú idő alatt. Továbbá, ha az időkorlátokat betartják (például a fent említett legfeljebb 36 órát), akkor fennáll annak a lehetősége, hogy a szövetminta nem lesz teljes egészében kellően rögzített (konzervált). Emiatt a néhány milliméternél vagy esetleg egy-két centiméternél nagyobb szélességű, fixálásra szánt szöveteket az optimális fixálás érdekében célszerű vékonyabb szegmensekre boncolni (Hewitt, et al., 2008). Az intézményeknek eltérő protokolljai lehetnek a különböző szélességű szövetmintákhoz szükséges fixálószer időtartamára és mennyiségére vonatkozóan, de általában a fixálószer térfogatának és a szövet térfogatának aránya 10:1 kell, hogy legyen (Klatt, 2016).

Dehidratálás

Az FFPE minták feldolgozásának második lépése a dehidratálás. Mivel a paraffin nem keverhető a vízzel, a formalinoldatból származó összes vizet el kell távolítani a szövetből, mielőtt a paraffin beszivároghatna. Alkoholos (gyakran etanolos) oldatok sorozata – gyakran a 70%-os alkohollal kezdve és a 100%-os alkoholig haladva – arra szolgál, hogy lényegében az összes vizet eltávolítsák a szövetből. Az optimális dehidratáláshoz friss oldatokat kell használni vagy gyakran cserélni a használt oldatokat, mivel az alkohol a használat során egyre hígabbá válik. Az is elengedhetetlen, hogy ezt a lépést teljes mértékben elvégezzük (elegendő időt szánva erre a lépésre), mert az elégtelen dehidratálás a szövetek lebomlásához vezethet (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Tisztítás

Mivel a paraffin valójában az alkoholokkal sem keverhető, a következő lépés az alkohol eltávolítása olyan anyaggal, amely a paraffinnal keverhető. Ezt a lépést nevezzük tisztításnak, és a leggyakrabban használt tisztítószer a xilol (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Paraffin infiltráció

A megfelelő fixálás, dehidratálás és tisztítás után a szövet végül paraffin infiltrációnak (vagy impregnálásnak) vethető alá. Ez a lépés szintén nem szabványosított, és a világ különböző pontjain működő intézmények különböző összetételű paraffinokat és viaszkeverékeket használhatnak. A paraffinok különböző olvadáspontokkal és textúrákkal rendelkeznek, amelyek hatással vannak a végső szövetblokkra és annak jellemzőire. Az Egyesült Államokban és Nyugat-Európában is általában alacsony olvadáspontú (55°C-63°C) szintetikus paraffinokat használnak a legjobb eredmények elérése érdekében. A készítménybe latex, dimetil-szulfoxid és saját fejlesztésű “lágyítószerek” is kerülhetnek a kész szövetminta textúrájának és alakíthatóságának módosítása érdekében (Hewitt, et al., 2008).

A világ más részein élő nemzetek gyakran használnak méhviaszt a készítménybe, hogy javítsák az alakíthatóságot és csökkentsék a felhasznált alacsony minőségű paraffinok olvadási hőmérsékletét. A méhviasz azonban tartalmaz szennyező anyagokat, például virágport, és csökkenti a végső minta minőségét. A magasabb olvadási hőmérsékletet kerülni kell, mert később a szövetminta csökkent és elégtelen deparaffinizálódását, valamint a szövetből kinyert nukleinsavak mennyiségének csökkenését eredményezi (Hewitt, et al., 2008).

Paraffinbeágyazás

Az FFPE minták feldolgozásának utolsó lépése a paraffinbeágyazás. A paraffinnal átitatott szövetmintát paraffinbevonat veszi körül. Ügyelni kell a szövetblokk helyes orientálására a formában (“kazettában”), mert ez befolyásolja a metszés síkját, amikor mikrotommal vékony metszeteket vágunk a blokkról (Klatt, 2016). Miután a paraffin burkolat megszilárdult, az FFPE blokk készen áll a tárolásra, és évekig, akár évtizedekig is jól megőrződik (Hewitt, et al., 2008).

Szelektálás

Amint a szövet beágyazódott, készen áll a metszésre a mikrotómával. Mivel a szövet nem mindig teljesen lapos a paraffin előlapjával szemben, a szövettanárnak általában “szembe kell néznie” a blokkba. A szövetblokkot a mikrotom blokktartójába helyezik, és miközben a szövettanár a blokktartó szögét úgy állítja be, hogy a lehető legkevesebb szövet menjen veszendőbe, a kézikereket forgatva a blokkot fel-le mozgatja az éles pengével szemben. A blokkot addig vágja, amíg a szövet egy teljes reprezentatív szakasza nem kerül a blokk előterébe. Amint a szövet szemben van, a blokkot jégre helyezik, hogy lehűljön, ami megkönnyíti a vékony metszetek vágását; a túl meleg paraffin összenyomott szövetet hoz létre, gyűrött metszetekkel. Amikor a blokk lehűlt, visszahelyezzük a blokktartóba. A technikus ismét forgatja a kézikereket, ezúttal lassú, egyenletes ütemben, hogy egymást követő vékony szelvényeket hozzon létre, amelyek egymáshoz tapadnak, “szalagot” alkotva.” A szalagot meleg vízfürdőre helyezzük (a hőmérsékletet éppen a paraffin olvadáspontja alatt tartjuk), hogy a kialakult ráncokat kisimítsuk. A technikus ezután egy mikroszkópos tárgylemezt helyez a vízfürdőbe, és “felkapja” a kiválasztott metszet(eke)t, hogy azok a tárgylemezre tapadjanak.

A szövetmetszetek leggyakoribb vastagsága 3-5 mikrométer (vagy röviden mikron) között van, ami egyetlen sejt vastagságának felel meg. A 3-5 mikronos metszeteket tartalmazó tárgylemezeket általában festéshez használják, legyen az a standard Hematoxilin & Eozin (H&E) festés, speciális festés vagy immunhisztokémiai (IHC) festés. A kutatók gyakran kérnek “fürtöket” a tárgylemezeken lévő vékony metszetek helyett. A göngyölegek vastagabb (10 mikronos vagy nagyobb) metszetek, amelyeket Eppendorf-csövekbe helyeznek, és általában akkor használják, amikor RNS-t vagy DNS-t kell kivonni az FFPE-mintákból. A vastag szelvényeket csövek helyett tárgylemezekre is lehet helyezni; ez akkor optimális, ha a szövetnek csak egy részét használják fel az extrakcióhoz. Ebben az esetben a szövetet lekaparjuk a tárgylemezről, és egy csőbe tesszük. A szeletelt FFPE minták szerkezetileg stabilak, és megfelelő kezelés és tárolás esetén a szeletelés után még egy ideig felhasználhatók mikroszkópos elemzésre, de ha kémiai extrakciót kell végezni, akkor általában a szeleteket a vágás után a lehető leghamarabb fel kell használni, hogy megelőzzék a feltárt célmolekulák oxidatív és biológiai degradációját.

A specifikus indikációkat képviselő FFPE blokkok szövettanáról és beszerzéséről keres információt? Tekintse meg szövettani forrásoldalunkat. A Lab-Ally iparági vezető szerepet tölt be a 45CFR46 és 21CFR11 megfelelés, az etikusan beszerzett humán biológiai minták, a bioinformatika, a tudományos adatkezelés és még sok más területen.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehid fixálás. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Változások a differenciális génexpresszióban a radikális prosztatektómiás minták meleg iszkémiás ideje miatt. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Szövetkezelés és mintaelőkészítés a sebészeti patológiában: A nukleinsavak visszanyerésének kérdései formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szövetekből. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehid, formalin, paraformaldehid és glutaraldehid: Mik ezek és mit csinálnak. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Retrieved from http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Formalin pigment (savas hematin) és rokon pigmentek. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Szövetrögzítés és a molekuláris fixálószerek hatása a későbbi festési eljárásokra. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). A rutinszerű formaldehid fixálás kémiai és fizikai alapjai. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). A fixálószerek és a szövetfeldolgozás hatása a nukleinsavak tartalmára és integritására. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). DNS extrakció formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szövetekből. Cold Spring Harbor protokollok. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Retrieved from http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accessed dec 28, 2016

Dec 28.