A dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) a nukleinsavmolekulák alapvető építőkövei, és mint ilyenek, a PCR-keverékek szükséges összetevői, mivel nélkülük nem keletkezhet új (amplifikált) DNS. A DNS-szekvenciát alkotó négy egyes dezoxinukleotid (pl. dezoxi-adenozin-trifoszfát, dATP; dezoxi-ti-midin-trifoszfát, dTTP; dezoxi-citozin-trifoszfát, dCTP; és dezoxi-guanozin-trifoszfát, dGTP) általában ekvimoláris mennyiségben adják a PCR- és RT-PCR-keverékekhez, bár ha a PCR-rel amplifikálandó cél-DNS-szekvencia főleg dATP/dTTP (AT arány) vagy főleg dGTP/dCTP (GC arány), akkor a PCR-keverékhez adott dNTP-k moláris arányát meg lehet változtatni, hogy figyelembe vegyük ezt az egyensúlyhiányt. A dNTP-ket általában egyenként vagy (ekvimoláris) keverékként vásároljuk a kereskedelmi beszállítóktól (pl. Roche, Promega stb.), és kémiailag stabilak, ha enyhén lúgos vizes oldatban tároljuk őket -20°C-on. Meg kell azonban jegyezni, hogy a dNTP-k oldatban természetesen savasak; ezért a munka- és törzsoldatokat a hosszú távú tárolás előtt lúgos vegyületekkel semlegesíteni kell. A semlegesített dNTP-oldatokat általában 10 mM-os törzsoldatokra állítják be spektrofotometriával, vagy a megfelelő mennyiségű steril víz hozzáadásával a liofilizált termékhez közvetlenül a kémiai szintézis után. Egyes PCR-ek esetében előnyös lehet a nagy tisztaságú “PCR-grade” dNTP-k (Roche) használata, amelyek kevesebb mint 0,9% dezoxinukleotid-difoszfátot (dNDP) tartalmaznak, >99%-os tisztaságúak, és mentesek az olyan szennyező anyagoktól, mint a módosított nukleotidok és a tetrapirofoszfát. Ezek a (drágább) nagy tisztaságú dNTP-k hasznosak lehetnek a cél-DNS nagyon alacsony kópiaszámú cél-DNS-t tartalmazó készítményekből származó PCR-DNS sikeres amplifikálásában.
Egyes PCR alkalmazásokban és protokollokban a négy dNTP egyike helyettesíthető egy analóg, dNTP-vel, pl. inozin, 7-deaza-2′ -deoxiguanozin, vagy egy módosított dNTP-vel, pl. biotin-, fluorofór- vagy radioaktívan jelölt dNTP-vel. Az ilyen módosítások lehetővé teszik további post-PCR feldolgozás utáni alkalmazások elvégzését.