Citrobacter freundii fitness during bloodstream infection

Citrobacter BSI izolátumok gyűjtése

A más, rendszeresen BSI-t okozó Gram-negatív fajokkal összehasonlítva a C. freundii fiziológiájáról a gazdakörnyezetben csak korlátozott információ áll rendelkezésre. E hiányosság kiküszöbölése céljából először nyolc, a C. freundii komplexhez tartozó izolátumot gyűjtöttünk a Michigani Egyetem Egészségügyi Rendszerén belül BSI-ben szenvedő betegekből. A riboszomális RNS-alapú filogenezis a Citrobacter-fajok három csoportját képes megkülönböztetni, amelyek közül az I. csoport legalább nyolc fajt foglal magában, és ide tartozik a C. freundii23,24 is. A 16S rRNS-szekvencia és a tömegspektrometrián alapuló azonosítási módszerek azonban korlátozott filogenetikai felbontást biztosítanak a Citrobacter-fajok e csoportján belül. Ezért az ebben a vizsgálatban használt izolátumokat a továbbiakban multilokusz szekvenciaelemzési megközelítéssel vizsgáltuk. A nyolc begyűjtött izolátum közül hat szorosan klasztereződött az ismert C. freundii törzsekkel (1. ábra), és átlagosan >98%-os nukleotid azonosságot mutatott az ATCC 8090-es típustörzzsel, ami az azonos faj izolátumaira jellemzően elfogadott 95%-os határérték felett van. A két fennmaradó izolátum közül az UMH17 a Citrobacter pasteurii CIP 55.13 típus törzsével, az UMH18 pedig a Citrobacter werkmanii törzsekkel klasztereződött a legszorosabban.

C. freundii bacteremia

A Citrobacter BSI alatti fitneszigényének vizsgálatát megelőzően a bacteremia egérmodelljét dolgozták ki más enterális fajokkal végzett korábbi munkák alapján25. A Citrobacter BSI izolátumok közül az UMH14 és UMH15 törzseket választották ki jelöltként a vizsgálathoz. Az UMH14 izolátum következetesebb dózisfüggő kolonizációt mutatott a lépben és a májban a farokvénás injekciót követő 24 órában (S1. ábra), ezért választottuk ki további jellemzésre. Szükséges volt a fertőzési modell tesztelése a lehetséges kolonizációs szűk keresztmetszetekre is, mielőtt az egyes C. freundii gének fitneszhez való hozzájárulását a transzpozonmutánsok nagy gyűjteményének felhasználásával értékeltük volna. Izoláltuk az UMH14 spontán nalidixinsav-rezisztens mutánsát (UMH14Nal), és megállapítottuk, hogy az in vitro fitnesz egyenértékű az anyatörzzsel gazdag táptalajon végzett ko-kultúra során (S2. ábra). Annak megállapítására, hogy a mutánsok változatos populációja létrehozható-e a véráramban az egyes klónok sztochasztikus elvesztése nélkül, az UMH14Nal és az UMH14 törzseket különböző arányban kevertük és egerekbe oltottuk. 24 óra elteltével akár 1:10 000-es (UMH14Nal:UMH14) arányokat is toleráltak anélkül, hogy a lépben alulreprezentált törzs spontán elvesztette volna az egyedet (S2. ábra), ami azt jelzi, hogy egyetlen egér legalább 10 000 egyedi transzpozonmutánst képes befogadni 5 × 107 baktérium összdózisban ezzel a modellel.

A Citrobacter fitneszgének azonosítása érdekében a bakteriémia modellben öt, >44 000 egyedi inszerciós helyet képviselő, véletlenszerű transzpozon inszerciós mutánsokból álló poolt injektáltunk egerekbe, és a lépet kolonizáló baktériumokat 24 óra elteltével visszanyertük (S3. ábra). Az egyes transzpozonmutánsok relatív abundanciáját az inokulumban és a lépben lévő kimenetekben, amint azt nagy áteresztőképességű szekvenálással meghatároztuk, felhasználtuk a modellben a baktériumok túléléséhez hozzájáruló gének azonosítására. Összesen 177 transzpozon-rombolt gén okozott szignifikáns fitneszveszteséget, és kilenc gén mutáció esetén a baktériumok fitneszének növekedésével járt (fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (S1 adatok). Egy második elemzés ezzel az adatsorral 546 kromoszómakódolt feltételezett esszenciális gént azonosított, amelyek esetében a beviteli populációban a leolvasások száma szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a rendelkezésre álló TA-helyek és a könyvtárpopuláció mérete alapján várható volt (logFC <-5,17) (Data S2). Az opportunista és szisztémás fertőzés e modelljét használva arra számítottunk, hogy az azonosított fitneszfaktorok többsége inkább alapvető fiziológiai folyamatokat képvisel majd, mint prototipikus virulenciafaktorokat (pl. fehérjetoxinokat vagy adhézineket). Valóban, a jelentős fitneszhibákkal összefüggésbe hozott 177 gén kategorizálása az ortológ csoportok (Clusters of Orthologous Groups, COG) szerint tükrözte a C. freundii bakterémia során szükséges metabolikus útvonalak és sejtfenntartó funkciók túlsúlyát (2. ábra). Az azonosított fitneszgének mintegy fele nagyjából öt COG-kategóriába illeszkedik, amelyek az energiatermelést, az aminosav-metabolizmust, a DNS-replikációt és -javítást, a transzlációt, valamint a sejtfal- és membránbiogenezist foglalják magukban.

Egyedi fitneszgénmutánsok validálása

Az egyes géntermékek hozzájárulását a C. freundii fitneszéhez a kiválasztott UMH14 génekben konstruált független deléciós-behelyezési mutációkkal igazoltuk (1. táblázat). Az itt közölt összes módosított törzs nem mutatott durva replikációs hibát, amint azt a gazdag táptalajon történő növekedés alapján megállapítottuk (S4. ábra). Az 1. táblázatban felsorolt minden gén esetében a fitnesz mérése úgy történt, hogy az egyes mutánsokat az UMH14 szülő törzzsel együtt fertőztük. Az eredetileg vizsgált hét mutánsból öt mutáns statisztikailag szignifikáns versenyhátrányt mutatott akár a lépben, akár a májban (3A. ábra), megerősítve ezzel a transzpozonszűrés eredményeit. A znuB mutánst negatív kontrollként választottuk ki a validáláshoz, mivel a transzpozonszűrés eredményei azt mutatták, hogy ehhez a génhez nem társul fitneszhiba, annak ellenére, hogy más baktériumfajokból származó bizonyítékok bizonyítják a ZnuABC cinkszállító rendszer hozzájárulását az egérfertőzéshez26,27,28 . Az UMH14-gyel való versenyben a znuB mutáns nem mutatott jelentős fitneszdefektust, ami összhangban van a várt eredményekkel. Az UMH14 szomszédos znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) és znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) génjei szintén vagy nem okoztak fitneszhibát, vagy minimális hibát, amikor transzpozon inszercióval mutálódtak (S1 adatok).

A tatC gén mutációja, amely az iker-arginin transzlokációs rendszer egyik komponensét kódolja, az összes vizsgált mutáns közül a legnagyobb fitneszveszteséget eredményezte (3. ábra). Annak megállapítására, hogy e mutáns csökkent fitneszét helyre lehet-e állítani genetikai komplementációval, a tatC nyílt leolvasási keretet tartalmazó pBBR1MCS-5 plazmidot bevittük a tatC mutánsba, és vizsgáltuk az így kapott törzs relatív fitneszét. A tatC mutáns kezdetben 67-szeres fitneszdefektust mutatott a lépben a vad típusú törzzsel versenyezve (3A. ábra), míg a komplementált tatC mutáns ugyanezen körülmények között csak kétszeres fitneszdefektust mutatott (3B. ábra). Hasonlóképpen, a komplementált tatC mutáns nem volt szignifikánsan versenyképtelen a májban az UMH14-hez képest. A pBBR1MCS-5 szülő plazmidról ismert, hogy szelekció hiányában stabilan fennmarad a fertőzés során29 , és a pBBR1MCS-5 vagy a tatC+ komplementációs plazmidot tartalmazó C. freundii tatC mutáns in vitro tenyésztése 24 óra alatt szelekció hiányában nem mutatott számottevő plazmidveszteséget (S5. ábra). Ezek az eredmények együttesen szilárdan bizonyítják a TatC működésének szükségességét a Citrobacter-baktériumémia során.

A fitneszgének megőrzése a Citrobacter-izolátumok között

A vizsgálat során minden Citrobacter-izolátum teljes genomszekvenciáját meghatároztuk, és minden törzs előre jelzett proteomját összehasonlítottuk az UMH14-gyel mint referenciával. Az UMH14 kromoszómán kódolt 4666 prediktált géntermékből 3742 konzerválódott ≥95%-os azonossággal a vizsgálatban szereplő összes C. freundii izolátum között (4A. ábra). Az összes törzs között konzervált fehérjék (≥95%-os azonosság) száma 2545-re csökken, ha az UMH17 és UMH18 prediktált proteomjait is figyelembe vesszük, ami összhangban van azzal, hogy ezeket az izolátumokat a C. freundii ágon kívülre helyezték a multilokusz szekvenciaelemzés alapján (1. ábra). Az UMH14 fitneszfaktorok konzerváltsága szintén magas volt, a nyolc baktériumtörzs között a megjósolt 177 fehérjéből 145 konzerválódott ≥95%-os aminosavazonossággal (4B. ábra), beleértve mind a hét eredeti, validálásra kiválasztott fitneszfaktort (1. táblázat és 3. ábra). Az UMH17 és UMH18 eltávolítása a vizsgálatból 162-re (92%) növelte a konzervált fitneszfaktorok számát. Ezek az eredmények egy olyan Citrobacter túlélési stratégiára utalnak a bakterémia során, amely nagymértékben függ a fajon belül konzervált fehérjéktől. Érdekes módon a törzsek ezen alcsoportján belül kevés fitneszfaktor volt teljesen egyedi (<30%-os azonosság) az UMH14-gyel. Az egyik figyelemre méltó példa egy feltételezett három génből álló operon (CUC46_23440-CUC46_23450), amelynek megfigyelt fitneszdefektusai 6- és 14-szeres között mozogtak. Mindhárom nyitott leolvasási keret hipotetikus fehérjéket kódol, és ezek közül csak a CUC46_23450 kódol egy konzervált domént, amelynek funkciója van (cd01713, foszfoadenozin-foszfoszfoszulfát reduktáz).

DNS-rekombinációs és javítási útvonalak

A vizsgálat egyik célja olyan konzervált biológiai útvonalak azonosítása volt, amelyekben több bakteriális fitneszfaktor is részt vesz. A DNS-rekombinációban és -javításban részt vevő RecBCD és RuvABC enzimkomplexek ilyen példát képviselnek. A RecBCD enzim a duplex DNS-végeken aktív, és szükséges a homológ rekombináció és a rekombinációs DNS-javítás folyamataihoz. E funkciókhoz kapcsolódóan a RuvABC enzim elősegíti a Holliday-elágazások vándorlását és feloldását30,31. A recB, recC vagy recD transzpozon inszerciója 6-8-szoros fitneszcsökkenést eredményezett, és hasonlóan a ruvA és ruvC transzpozon inszercióval történő megszakítása is >30-szoros fitneszveszteséget eredményezett (S1 adat). Fontos, hogy a ruvA fitneszdefektust megerősítették a vad típusú törzzsel szembeni kompetitív fertőzéssel, egy függetlenül konstruált mutáns segítségével (3A ábra). A két multifehérje-komplexen belül csak a RuvB-t nem azonosítottuk jelentős fitneszfaktorként az adathalmazunkban. Mindkét fehérjekomplexről ismert, hogy részt vesz a normál kromoszómaszintézis során előforduló elakadt vagy összeomlott DNS-replikációs villák feloldásában30 , bár fontos, hogy a ruvA mutáns a vad típusú törzshez hasonlóan növekedett a gyors replikáció során gazdag közegben (S4. ábra). Kísértő a feltételezés, hogy a gazdakörnyezetben bekövetkező bakteriális DNS-károsodás – esetleg az immunsejtek által közvetített reaktív oxigénfajok termelődése révén – szintén hozzájárulhat az e komplexek iránti igényhez.

A twin-arginin transzlokációs rendszer

A twin-arginin transzlokációs rendszer Gram-negatív baktériumfajokban úgy működik, hogy összehajtott fehérjéket szekretáljon a citoplazmamembránon keresztül. A TatC szerepe ebben a konzervált multifehérje-rendszerben a szekréciós szignálszekvenciák felismerésében van az ezen az útvonalon keresztül exportált fehérjék számára. Miután megállapítottuk a tatC gén jelentős hatását a C. freundii in vivo fitneszére (3. ábra), arra gondoltunk, hogy a Tat rendszer által szekretált fehérjékre az egérmodellben is szükség lehet a fitneszhez. A Tat által szekretált feltételezett fehérjék azonosítása érdekében mind a 177 fitneszfaktor N-terminális szekvenciáját elemeztük a TatP 1.0 predikciós szoftver32 segítségével. Két gént, a CUC46_16565 és a CUC46_16060 gént azonosítottunk, amelyek Tat-függő, iker-arginin motívumokat tartalmazó szignálpeptideket kódolnak. A CUC46_16565 termék 94%-os aminosavazonosságot mutat az E. coli SufI fehérjével, beleértve az iker-arginin motívum és a szignálpeptid hidrofób részének 100%-os konzerváltságát33. A C. freundii sufI génjét mutáltuk, és az UMH14 szülő törzzsel versenyezve vizsgáltuk a fittséget, hogy megállapítsuk, hogy a TatC elvesztésével járó fitneszdefektus a SufI funkció megzavarásának tulajdonítható-e (5A. ábra). Valóban, a sufI mutáns törzs a lépben 7-szeres, a májban pedig 17-szeres konkurenciát mutatott a vad típusú törzshöz képest. Mivel azonban a tatC mutáció fitneszköltsége 67-szeres és 112-szeres között mozgott a vad típusú baktériumokkal való versenyben (ábra. 3), a sufI mutáció viszonylag alacsony fitneszköltsége arra utalt, hogy további Tat-függő szubsztrátok is hozzájárulhatnak a fitneszhez. A SufI Tat-függő szekréciójának létrehozására tett kísérletek a C. freundii-ben sikertelenek voltak a C-terminális FLAG epitiop-jelölésű SufI-konstrukció expressziójával kapcsolatos nyilvánvaló toxicitási problémák miatt, különösen a tatC mutáns törzsben (az adatok nem láthatóak). A SufI-t azonban számos, az E. coli Tat-rendszerét jellemző vizsgálatban használták Tat-szekretált fehérje modellként.

A második azonosított potenciális Tat-szekretált fitneszfaktor, amelyet a CUC496_16060 kódol, egy prediktált prolin-aminopeptidáz (PRK10879), amely a PepP szupercsaládba tartozik. A pepP-gént nélkülöző mutáns törzs a lépben kb. 3-szoros, a májban kb. 2-szeres konkurenciát mutatott, de a vad típushoz képest megfigyelt fitneszhátrány statisztikailag nem volt szignifikáns (5A. ábra). Ennek ellenére a PepP szubcelluláris lokalizációját egy C-terminális FLAG epitóp-jelölt származék segítségével határoztuk meg, amelyet egy több kópiát tartalmazó plazmidon hordoztunk (PepPFLAG). A tatC mutánsban az UMH14-hez képest váratlanul alacsony PepPFLAG-szintet detektáltunk; a PepPFLAG fúziós fehérje azonban mindkét vizsgált törzsben elsősorban a citoplazmatikus frakcióban volt megtalálható (S6. ábra), és nem kaptunk bizonyítékot a PepP fehérje Tat-függő szubcelluláris lokalizációjára. A sufI mutáns kompetitív fertőzési eredményeivel együtt ezek az adatok tovább erősítik azt az elképzelést, hogy további Tat-függő fitneszfaktorok vannak jelen a C. freundii-ben, vagy hogy a Tat-rendszeren keresztül történő fehérjetranszlokáció kumulatív elvesztése meghaladja az egyes szubsztrátok funkcióvesztését.

A funkcióvesztéses tat-mutánsokkal kapcsolatos egyik uralkodó fenotípus a fajok között a motilitás károsodása34,35,36,37 . A C. freundii egy zászlós baktérium, amely képes úszómozgásra puha agar mátrixban. A C. freundii tatC mutáns a vad típusú törzshez képest körülbelül 2-szeres csökkenést mutatott az úszómotilitásban, és az úszómotilitás teljes mértékben helyreállt genetikai komplementációval transzban (5B,C ábra). Ezek az eredmények egyértelműen mutatják a TatC funkció hiányában fellépő motilitási hibát; mivel azonban a tatC mutánsban továbbra is alacsony szintű úszás volt megfigyelhető, valószínűleg megmaradt némi flagelláris funkció. A fliQ kivételével a bakterémia során azonosított flagellákhoz kapcsolódó fitneszgének általános hiánya arra utal, hogy a tatC fontossága a C. freundii fitneszében nagyrészt független lehet az ebben a törzsben megfigyelt flagellák diszfunkciójától.

A metabolikus fitneszútvonalak

Amint korábban említettük, az azonosított Citrobacter fitneszgének jelentős részének metabolikus útvonalakon való működését jósolták (2. ábra). Három különböző gént, amelyek a központi szénanyagcsere (pfkA), a fruktóz- és mannózanyagcsere (mtlD) és az aminosav-bioszintézis (cysE) komponenseit képviselik, választottunk ki további vizsgálatra. A bakteriális cisztein bioszintézis L-szerinből történik az O-acetil-L-szerin (OAS) köztiterméken keresztül. Az E. coli modellút első lépését a CysE O-acetiltranszferáz enzim katalizálja, és a cysE elvesztése cisztein auxotrófiát eredményez38,39 . A C. freundii cysE mutáns szintén nem képes szaporodni ciszteinhiányos definiált táptalajon (6A. ábra), de közel a vad típusú sűrűségeket képes elérni, ha a táptalajt OAS-szal (6B. ábra) vagy ciszteinnel (6C. ábra) egészítettük ki. A cysE mutáció genetikai komplementálása a növekedés részleges helyreállítását eredményezte cisztein hiányában. Érdekes módon a cysE mutáns baktériumok növekedésének teljes hiánya OAS vagy cisztein hiányában in vitro ellentétben áll a fertőzés során megfigyelt részleges fitneszhibával (3A. ábra). Ez arra utal, hogy a Citrobacter képes lehet ezeket a metabolitokat a véráram környezetéből beszerezni, mégis fitneszköltséggel jár a bioszintetikus útvonal megszakítása.

A Citrobacter gazdatest-asszociált anyagcseréjének vizsgálata keretében vizsgáltuk, hogy a baktérium képes-e különböző szénforrások hasznosítására. Más enterális fajok PfkA foszfofruktokináz enzimét széles körben jellemezték, amely a glikolízis első elkötelezett lépését képviseli, és a fruktóz-6-foszfát fruktóz-1,6-biszfoszfáttá történő foszforilálását katalizálja. Az UMH14 esetében a pfkA mutációja megszüntette e törzs azon képességét, hogy kizárólagos szénforrásként glükózzal szaporodjon (6D. ábra), ami részben helyreállítható volt a pfkA multikopiás plazmidon történő biztosításával. A glükóz hasznosításának ez a teljes elvesztése in vitro korrelált a fitnesz kétszeres csökkenésével a bakterémia során (3A. ábra). Mivel a glükóz bőséges szénforrás az emlősök szérumában40 , ezek az eredmények összhangban vannak a Citrobacter glükóz hasznosításának szerepével a fertőzés során, de arra is utalnak, hogy a Citrobacter metabolikus repertoárja megkönnyítheti az alternatív szén- és energiaforrások hasznosítását.

Egy másik, fruktóz-6-foszfátot érintő enzimaktivitást is vizsgáltak a Citrobacter bakterémiához való hozzájárulása szempontjából. A mannitol-1-foszfát-5-dehidrogenáz fehérje, az MtlD elősegíti a mannitol-1-foszfát és a fruktóz-6-foszfát kétirányú átalakítását NAD+ vagy NADH mint kofaktor felhasználásával41,42. Több bélbaktériumfaj is képes a mannitol cukoralkoholt egyedüli szénforrásként hasznosítani a hexitol-foszfenolpiruvát-függő foszfotranszferáz rendszeren keresztül történő transzportot követően, ami a mannitol-1-foszfát intracelluláris felhalmozódását eredményezi43,44 . A mannitol-1-foszfát egyik lehetséges sorsa az MtlD-függő oxidáció fruktóz-6-foszfáttá, majd ezt követően a glikolitikus útvonalba való vezetés. A C. freundii mtlD mutáns ötszörös fitneszcsökkenést mutatott egérmájban (3A. ábra), és ez a megfigyelés arra ösztönzött, hogy kísérleteket végezzünk annak megállapítására, hogy a C. freundii képes-e ilyen típusú metabolizmusra in vitro. Az UMH14 és az mtlD származék törzseket mannitot tartalmazó definiált táptalajban tenyésztettük, és az így kapott növekedési görbék azt mutatják, hogy a vad típusú baktériumok és a komplementált mutáns képes volt szaporodni ilyen körülmények között, míg az mtlD törzs nem (6E. ábra). A várakozásoknak megfelelően az mtlD mutáns közel vad típusú szintre tudott szaporodni, amikor aerob körülmények között glükózt kaptak szénforrásként (6F. ábra). Ezek az eredmények együttesen igazolják mind a C. freundii azon képességét, hogy a mannitot egyedüli szénforrásként hasznosítja, mind az mtlD szükségességét ebben a folyamatban.

A kórokozók közös fitnesz-stratégiái a véráramkörben

Korábban egy másik opportunista kórokozó, a S. marcescens fitneszigényét vizsgáltuk egy hasonló bakterémia egérmodell segítségével. A S. marcescens vizsgálat eredményei között szerepelt 212 fitneszgén azonosítása a jelen munkához hasonló technikákkal45. Annak megállapítására, hogy ezek a fajok osztoznak-e a BSI során a fitneszhez vezető közös útvonalakon, először a két faj előre jelzett proteomjait hasonlították össze. A fehérjéket homológnak tekintették a C. freundii és a S. marcescens között, ha a szekvencia ≥50%-án ≥70%-os aminosav azonosságot mutattak. Összesen 42 homológ fehérjét azonosítottak jelentős fitneszfaktorként mindkét szervezetben (S1. táblázat), a közös fitneszfaktorok listáján számos különböző funkciót képviselnek. Figyelemre méltó, hogy a RuvA fehérjét, amelynek elvesztése a C. freundii fitneszének >10-szeres csökkenését eredményezte kompetitív fertőzéssel (3A ábra), a RuvC-vel együtt fitneszfaktorként azonosították a S. marcescensben. Ezek az eredmények tovább erősítik azt a hipotézist, hogy a Holliday-összeköttetés-komplexek felbontása, esetleg a DNS-károsodás rekombinációs javítása során, fontos az in vivo fitnesz szempontjából ezekben az organizmusokban. A PfkA foszfofruktokináz enzimet szintén fitneszfaktorként azonosították mindkét fajban. A Citrobacter esetében megfigyeltekhez hasonlóan a S. marcescens pfkA szükséges a glükóz egyedüli szénforrásként való hasznosításához, és szükséges volt továbbá az optimális bakteriális szaporodáshoz hővel inaktivált emberi szérumban45. Mindkét szervezetben a pfkA hozzájárult a lépben a transzpozonszűréssel vizsgált fitneszhez, bár érdekes módon a S. marcescens pfkA mutáns a vad típusú törzzsel való versengő fertőzés során a vesében is kb. 9-szeresére csökkent fitneszt mutatott. E munka során megfigyelték, hogy a C. freundii UMH14 vad típusú törzs viszonylag gyenge kolonizációt mutatott a vesében a BSI modellben, de a Proteus mirabilis pfkA génjéről kimutatták, hogy hozzájárul a vesében a fitnesshez húgyúti fertőzést követően46. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy egy adott környezetben konzervált fitneszstratégiákat lehet azonosítani az egyes organizmusok között. További munkára lesz szükség annak meghatározásához, hogy ezek a géntermékek további BSI-t okozó szervezetekben is szükségesek-e, és hogy ezek a konzervált fitneszpályák kihasználhatók-e.