December 4-én meglátogattam a Pennsylvania holland vidékének szívében található Különleges Gyermekek Klinikáját, ahol egy apró személyzet több mint 2000, különféle örökletes betegségben szenvedő beteget ápol. A múlt heti bejegyzésemben egy olyan családot írtam le, amelyben 6 gyermekből 5 olyan rohamos rendellenességben szenved, amely autisztikus vonásokat is tartalmaz. Ennek a szindrómának az elmúlt 15 évben végzett vizsgálata szépen illusztrálja a génfeltárási módszerek fejlődését, mielőtt a szekvenálás egy új technológiai korszakba katapultált volna minket. (Figyelem: szakzsargon következik.)
FENOTÍPUS ÉS GENOTÍPUS KAPCSOLATA
Az okozó génváltozatok (allélek) azonosítása érdekében a kutatók manapság a szülők és esetleg a testvérek exom (a genom fehérjéket kódoló része) szekvenciáit hasonlítják össze, hogy azonosítsák az okozó génváltozatokat (allélokat). Ez gyors.
A genom előtti korszakban a kutatók közvetett úton jutottak el a fenotípustól a genotípusig:
– Megállapították, hogy a tünetek “családban jelentkeznek.”
– Megállapították, hogy az állapot gyakrabban fordul elő egypetéjű ikreknél, mint kétpetéjű ikreknél, és a betegek testvérei között, mint az általános populációban.
– Abnormális kromoszómák azonosítása a betegségben szenvedőknél.
– Genom-szintű asszociációs vizsgálatok (GWAS) alkalmazása a genetikai variáció mintázatainak azonosítására (az egy bázisú helyek csoportjainál, az úgynevezett egynukleotid-polimorfizmusoknál vagy SNP-knél), amelyek jelezhetik a betegséget okozó variánst.
– A gén azonosítása és egérmodell készítése a kezelések tesztelésére.
Amikor az amisok az 1700-as évek elején a vallási üldöztetés elől elhagyva Svájcot, Pennsylvaniában telepedtek le, az európai génállományból hoztak magukkal egy mintát. Az egymás közötti szaporodás felerősítette a mutációkat, és “autozigóta futásokat” eredményezett a genomjukban – a kromoszómák olyan szakaszait, amelyek mindkét példányában ugyanaz a DNS-szekvencia található. Az autozigótiafutások azt jelzik, hogy két rokon egy közös őstől örökölt génváltozatokat, például másod-unokatestvérek egy dédszülőtől. Ezek az allélok, amelyeket “leszármazási azonosságnak” (IDB) neveznek, hatékony eszközt jelentenek a gének felfedezéséhez, ha kizárólag olyan embereknél jelennek meg, akiknek ugyanaz a betegségük.
Az AMISH KAPCSOLAT
A fiú, akivel a klinikán találkoztam, és 5 testvére közül 4 testvére kortikális diszplázia-fokális epilepszia (CDFE) szindrómában szenved. Ez a CNTNAP2 nevű gén egyetlen hiányzó DNS-bázisából ered.
A génfelfedezések számos történetéhez hasonlóan az a felfedezés, hogy a CNTNAP2 mutációi állnak a különböző agyi betegségek – autizmus, görcsrohamok, skizofrénia, Tourette-szindróma és nyelvi zavarok – hátterében, különböző szálakkal kezdődött. Koncentráljunk az autizmussal való kapcsolatra.
Még a legrégebbi genetikai technikák is bizonyítják az autizmus örökletes komponensét. Az egypetéjű ikreknél sokkal nagyobb valószínűséggel fordul elő mindkettőjüknél, mint a testvéri ikreknél; az autizmussal élő gyermek testvéreinek kockázata 75-ször nagyobb, mint az átlagpopulációé.
1998-ban az Autizmus Nemzetközi Molekuláris Genetikai Tanulmányozása Konzorcium a GWAS segítségével 6 olyan régiót azonosított a genomban, amely az autizmussal élő embereknél nyomon követhető – a legnagyobb esélyes a hetedik legnagyobb kromoszóma hosszú karján, a “7q-n” volt.
1999-ben a kutatók a CASPR2-t, egy neurexinnek nevezett fehérjetípust hoztak összefüggésbe, amely, ha rendellenes, megzavarja az idegimpulzus küldését. A neurexinek más, neuroligineknek nevezett fehérjékkel összehangolódva hozzák létre azokat a szinapszisokat, amelyek akkor alakulnak ki, amikor egy kisgyermek elkezdi felfedezni a világot, és a memóriát tanulássá konszolidálják.
2003-ban jelentették, hogy a CASPR2-t kódoló gén, a CNTNAP2 átrendeződését a Tourette-szindrómás embereknél, 2007-ben pedig olyan embereknél, akiknél értelmi fogyatékosság, fejlődési késés, beszédzavar és hiperaktivitás van, de nem Tourette-szindróma. Ezek a különböző állapotok nem meglepőek – a hatások attól függően változnak, hogy az agyban hol van egyensúlyban a neurexin szintje.
2006-ban a Clinic For Special Children és a Translational Genomics Research Institute kutatói a CNTNAP2 mutációját a CDFE-szindrómával hozták összefüggésbe szorosan rokon amish gyerekeknél. A rohamok körülbelül abban az életkorban kezdődnek, amikor az autisztikus vonások általában megjelennek – 14-20 hónapos korban.
A rohamok kezdete előtt a CDFE tünetei finomak: kisebb motoros késések, gyenge mély ínreflexek és kissé nagy fej. A gyermekeknek nehézségeik vannak a koncentrációval, az emberek utánzásával és a mozgások tervezésével, mint például a kúszás, a cirkálás és a járás. A rohamok gyakoriak és súlyosak, és kezdetük a nyelvi, kognitív és szociális készségek hanyatlását jelzi. Néhány év múlva a rohamok megszűnnek, de az intellektus gyermekkorban megreked, és az egyén egész életen át tartó gondozásra szorul.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, és Holmes Morton, MD, a Klinika munkatársai és kollégáik 100 000 SNP-s microarray-eszközzel elemezték három amish családból származó négy CDFE-szindrómás gyermek DNS-ét. Találtak egy 7,1 millió bázis hosszúságú autozigóta régiót a 7q gyanús területen. (Ma már az algoritmusok gyorsan kiszúrják az autozigóziót az exomszekvenciákban.)
A 7,1 millió bázis 83 gént tartalmaz, de csak néhánynak volt értelme. A csapat először a CENTG3 nevű gént szekvenálta, amelyről ismert, hogy más agyi rendellenességeket okoz. De a beteg gyerekeknek nem voltak benne mutációk.
Akkor Dr. Puffenberger, a csapat genetikusa talált egy rövidítést: észrevett egy SNP-t a CENTG3 közepén, amely két gyereknél heterozigóta volt (két különböző variáns), nem pedig homozigóta (ugyanaz a variáns mindkét kromoszómakópiában), ami véget vetett a származásonként azonos régiónak. “Egy rekombinációs esemény a gén közepén lehetővé tette Eric számára, hogy megszabaduljon a gén nagy részétől, és megtalálja a mutációt. Ez tökéletes példája annak, hogy ‘a véletlen a felkészült elmének kedvez'” – mondta Dr. Morton. Ez a felfedezés 3,8 millió bázisra csökkentette az érdekes régiót a 7q-n.
A második jelölt gén, a CNTNAP2, áthidalja az érdekes régiót. Mindegyik gyermeknek hiányzott egy-egy bázis a 7-es kromoszóma mindkét kópiájáról, és mindkét szülőnek ugyanez a mutációja volt, de csak az egyik kópiában. Ők hordozók. Mendel első törvénye működött.
A csapat megtalálta a génjüket. Ezután tovább keresték a közösségben, és 105 egészséges amish ember közül négyen voltak hordozók. A 18 beteg közül, akiknek részleges rohamai voltak, de nem volt konkrét diagnózisuk, 7 családból kilencnek volt CDFE-szindrómája.
A rohamok rejtélyesek voltak. “Egy mutáció különböző típusú rohamokat okozhat. Egy családban négy gyerek másképp reagál. Néhányan nagyon fogyatékosak, mások nem nagyon érintettek” – mondta Dr. Morton. Három gyereket megműtöttek, hogy enyhítsék a rohamokat, de a megkönnyebbülés nem volt tartós. A műtétek azonban olyan agyszövetmintákat szolgáltattak, amelyek lehetővé tették a kutatók számára, hogy jobban leírják, mi a baj.
A rohamra hajlamos agyakban az összeköttetések rendezetlenek. A szürke és a fehérállomány határai elmosódnak, és az agykéreg egyes részei megvastagodtak. Maguk az idegsejtek sincsenek teljesen rendben. Túl gömbölyűek, túl sűrűn helyezkednek el, a dendritikus fák rendezetlenek. A neuronokon lévő pöttyök túl sok sejtmagot jeleznek a glia sejtekből, a támogató sejtekből, amelyek az idegrendszer nagy részét alkotják. A 2006-os kutatási jelentés költői módon írta le az amygdala, az érzelmek székhelye, az epilepsziás agyakban az “ámokfutó gliákba burkolt, részben érett neuronális elődsejtek excentrikus mikroszkopikus szigeteiként, szoros csoportokban”.
Az amish epilepsziás agy portréja a neurexin fehérjével, a CASPR2-vel (ami a contactin-associated protein-like 2 rövidítése) kapcsolatos munka fényében nyert értelmet. A neurexin állványzatot képez a Ranvier-csomópontokban. A csomópontok az axon exponált helyei a mielin párnái között, a szigetelő anyag, amely valójában a glia sejtmembránja, amely úgy tekeredik a neuron köré, mint egy kötés az ujj köré. Az idegimpulzusok megkerülik a csomópontokat, és elég gyorsan küldik az üzeneteket az élet fenntartásához.
A CASPR2 fehérjék az amish gyerekeknél csökevényesek. Nem haladnak át az idegsejtek membránján és nem merülnek a citoplazmába, ahogy kellene, és ennek következtében a közeli káliumcsatornák összeomlanak. Ezek a csatornák normális esetben lehetővé teszik a káliumionok kiáramlását az idegsejtekből, amikor egy impulzus átmegy, visszaállítva azt. A neurexin állványzat nélkül tehát az idegsejt nem tudja magát visszaállítani. A transzmisszió leáll. És valahogyan elkezdődnek a rohamok. Azt hiszem, nem tudni, hogy a rohamok indukálják-e az autisztikus jellegzetességeket, vagy közvetlenül keletkeznek – a további genetikai vizsgálatoknak ezt kell kideríteniük.
Egy egérmodell
Daniel Geschwind, MD, PhD és a UCLA David Geffen School of Medicine neurológia professzora az autizmus génjein dolgozott, és olvasta a 2006-os cikket a New England Journal of Medicine-ben. “Felhívott, és azt mondta: ‘Megtaláltad az én génemet! Szép együttműködés kezdődött, és készített egy egeret az amish mutációval” – mondta Dr. Morton. Az egereknél kiütötték a CNTNAP2 gént, és az emberekhez hasonlóan görcsrohamokkal és autisztikus vonásokkal rendelkeznek.”
“Az egér általában körbe-körbe rohangál a ketrecben, általában szociális és fecsegő. Ezek az egerek egyik sem voltak” – magyarázta Dr. Morton. Az egerek ismétlődő viselkedést mutattak, és rohamaik is voltak.”
A mutáns egerek agya a korábbi szövettani munkákra emlékeztető abnormális kapcsolódási mintázatot mutatott. “Az agy elülső része leginkább önmagával beszélget. Kevésbé kommunikál az agy más részeivel, és nincsenek hosszú távú kapcsolatai az agy hátsó részével” – mondta Dr. Geschwind. A csoport hasonló rendellenességeket mutatott ki autista gyermekek agyában.
Az amis gyerekek és az egerek közötti feltűnő hasonlóság a gyógyszerek tesztelésének terepét biztosítja. A gyermekek ismétlődő viselkedésének kezelésére felírt riszperidon ugyanilyen hatást gyakorolt az egerekre, miközben javította a fészeképítő képességüket is. A gyógyszer azonban nem segíti a gyerekek szocializálódását.
A szociális készségek javítására nyilvánvalóan alkalmas gyógyszerjelölt az oxitocin nevű “szeretethormon”. Ugyanazokban az agyi neuronokban van bőségesen jelen, amelyekben a CASPR2 fehérje is gazdag. A túl kevés oxitocin okozhat autisztikus vonásokat? Az oxitocin pótlásának eredményei ígéretesek, mind egereknél, mind gyermekeknél.
Dr. Geschwind és munkatársai megállapították, hogy az oxitocin orrspray “drámaian javítja a szociális deficitet” az egereknél. Mivel a nem-autista egerek nem reagáltak, úgy tűnik, a hormon valóban kompenzálja a hiányt.
Amish farmerek már adnak oxitocint a teheneknek, hogy összehúzzák a méhizmaikat, és emlékszem, hogy kaptam, hogy felpörgessem az elakadt szülést. De ezt ne próbáld ki otthon. Számos klinikai kísérlet folyik az oxitocinnal vagy az agyi aktivitását fokozó gyógyszerekkel, hogy javítsák a szocializációt autista gyermekeknél.
Autism Speaks 2010-ben finanszírozta az oxitocin első klinikai kísérletét, és az NIH szponzorálja az oxitocin orrspray nagyobb, folyamatban lévő kísérletét. De amennyire én tudom, a betegeket a DSM-IV szerinti klinikai diagnózisok alapján vették fel – nem pedig a genotípus specifikusabb kritériuma alapján.
Noha az ötlet, hogy az oxitocint kipróbálják az autizmus szociális tüneteinek javítására, nem igényelte a háttérben meghúzódó mutáció ismeretét, az ilyen információ a mechanizmus figyelembevételével pontosabbá tehet minden következtetést – ami más kezelések kifejlesztéséhez vezethet. Egy másik bejegyzésben azt fogom megvizsgálni, hogy a genetikai pontosság hogyan tette lehetővé Dr. Morton számára, hogy gyógymódokat dolgozzon ki bizonyos veleszületett anyagcsere-hibákra, amelyek sokkal gyakoribbak az amishoknál, de mégis mindenki újszülöttkori szűrővizsgálatain megjelennek.