Albers-Schönberg-kór (autoszomális domináns oszteopetrózis, type II) results from mutations in the ClCN7 chloride channel gene

Abstract

Az Albers-Schönberg-kór, vagy autoszomális domináns osteopetrosis, type II (ADO II), az osteopetrosis leggyakoribb formája, egy olyan betegségcsoport, amelyet a csont- és porcrezorpció károsodása miatt megnövekedett csonttömeg jellemez. Miután az ADO II-t okozó gént a 16p13.3 kromoszómára rendelték, most a ClCN7 kloridcsatornát kódoló gén hét különböző mutációjáról számolunk be mind a 12 elemzett ADO II családban. Ezenkívül egy, az oszteopetrozis súlyos, autoszomális recesszív, infantilis formájában (ARO) szenvedő beteget azonosítottunk, aki homozigóta a ClCN7 mutációra. A genotípus-fenotípus összefüggések alapján úgy tűnik, hogy az ADO II domináns negatív hatást tükröz, míg a ClCN7 funkcióvesztéses mutációi heterozigóta egyénekben nem okoznak rendellenességet. Mivel egyes ARO betegeknél a ClCN7 gén mindkét kópiájában mutáció van, az ADO II allélos az ARO esetek egy alcsoportjánál.

Elfogadva 2001. október 2-án; Átdolgozva és elfogadva 2001. október 11-én.

INTRODUCTION

Egészségünkben a csontszövet átalakulása a csontképződés és -felszívódás kiegyensúlyozott folyamatainak eredménye. A túlzott reszorpció csontritkulást okoz, amely a legtöbb nem traumás törésért felelős (1). Ezzel szemben a hibás csontfelszívódás osteopetrosist okoz, amelyet sűrű, de általában törékeny csontok jellemeznek. Az osteopetrosisnak legalább nyolc típusát írták le emberekben (2). A szénsav anhidráz II izoenzim hiánya autoszomális recesszív oszteopetrózist (ARO) okoz, vese tubuláris acidózissal és agyi meszesedéssel (3; MIM 259730), míg a malignus ARO (4; MIM 259700) eseteinek többsége a TCIRG1 gén mutációját tükrözi (5,6). Az osteopetrosis néhány ritka, nyilvánvalóan autoszomális recesszív öröklődési móddal rendelkező esete enyhébb fenotípust mutat, ezért “köztes” formának nevezik (7,8; MIM 259710).

Az autoszomális domináns osteopetrosis (ADO) sokkal gyakoribb, mint recesszív társai (9). Viszonylag jóindulatú klinikai képe miatt azonban, mivel sok beteg tünetmentes, és csak véletlen röntgenvizsgálattal fedezik fel, az ADO prevalenciáját alábecsülik. Az ADO-s családok körében általában két altípusról számolnak be, elsősorban a radiológiai jellemzők alapján (10,11). Az I. típus (ADOI) generalizált, diffúz oszteoszklerózisra jellemző, amely különösen a koponya boltozatát érinti (11). A II. típus (ADO II; MIM 166600), az eredetileg 1904-ben Albers-Schönberg által leírt forma (12), a leggyakoribb forma, amelynek becsült prevalenciája 5,5/100 000-re tehető (13). Klinikai megnyilvánulásai közé tartoznak a nem traumás törések, különösen a hosszú csontok, a koponyaidegek bénulásai, a csípő osteoarthritis és az alsó állkapocscsont osteomyelitis (14). Az ADO II radiográfiailag szegmentáris oszteoszklerózisban nyilvánul meg, túlnyomórészt a csigolya véglemezeknél (“rugger jersey gerinc”), a csípőszárnyakon (“csont a csontban” jel) és a koponyaalapon (9) (1. ábra).

A közelmúltban egy genom-szerte végzett kutatás eredményeként az ADO II alapjául szolgáló gént a 16p13.3 kromoszómához rendeltük (15). Érdekes módon a ClCN7 kloridcsatornát kódoló gén a jelölt régióban, 8,4 cM-en belül található (16). A kloridcsatorna ugyanis nélkülözhetetlen a csontszövet oszteoklasztok által közvetített lebontásához szükséges extracelluláris reszorpciós lacuna savasodásához (17), és egy ARO-s betegnél mutálódott (17). Ezért a ClCN7-et az Albers-Schönberg-kór okozójának pozicionális és funkcionális jelölt génjének tekintettük.

Eredmények

Az ADO II családok mutációelemzése

Mivel a ClCN7 gént is tartalmazó genomiális szekvencia elérhető a szekvencia-adatbázisokból (GenBank accession nos AL031600 és AL031705), az exonok és intron-exon határok mutációelemzése genomiális DNS felhasználásával lehetséges. Ez az erőfeszítés hét jellegzetes mutációt tárt fel a ClCN7 génben (2. ábra) 12 nem rokon ADO II családban (1. táblázat). Öt mutáció missense, egy egy aminosav delécióját eredményezi, egy pedig két nukleotidot töröl, ami a fehérje C-terminális végét érintő frameshiftet okoz. E mutációk egyike sem volt megtalálható 100 kontroll kromoszómában.

Négy mutáció redundáns mutáció. A 2423delAG mutációt egy franciaországi és egy amerikai családban azonosították. A G215R mutáció egy francia, egy dán és egy amerikai családban fordult elő. A P249L mutációt egy francia és egy német családban találták. Végül az R767W mutációt egy francia és egy amerikai családban azonosították (1. táblázat). A vizsgált családok eltérő földrajzi eredete, valamint a ClCN7 gént flankáló mikroszatellita markerek elemzése (adatok nem láthatóak) arra utal, hogy ezek független mutációk, azaz nem egy közös őstől öröklődtek.

Mutációelemzés egy ARO-betegnél

A 16p13.3 kromoszómáról származó markerekkel végzett kapcsolatelemzés egyértelműen homozigozitást mutatott minden marker tekintetében egy vérszerinti, egészséges szülőktől született ARO-betegnél (az adatok nem láthatóak). Ezért elvégeztük a ClCN7 mutációanalízisét, amely homozigóta miszenzmutációt mutatott ki a 766-os pozícióban (L766P) (2. ábra). Mindkét szülő heterozigóta erre a mutációra.

Mutált aminosavak elhelyezkedése és konzerváltsága

A ClC kloridcsatornák számára javasolt transzmembrán topológia 10-12 transzmembrán doménre utal (18). A miszense ADO II mutációkban érintett öt aminosav, valamint az ARO betegben érintett mutáció mindegyike erősen konzervált a ClC kloridcsatorna géncsalád különböző tagjai között (3. ábra). A G215R és a P249L mutációk három, illetve két nem rokon család betegeinél előforduló, ismétlődő mutációk (1. táblázat). A G215 egy erősen konzervált maradék, amely a D2 és D3 között helyezkedik el (4. ábra), egy olyan régióban, amelyről ismert, hogy befolyásolja a csatornák pórusának tulajdonságait (19), míg a P249 egy erősen konzervált, a ClC csatorna pórusának jelentős részét alkotó szerkezeti elemben vesz részt (20). Az R286 az extracelluláris térben, közvetlenül a D5 transzmembrán doménen kívül helyezkedik el. Ez az aminosav konzervált a különböző ClC-fehérjék között, a ClC1 és ClC2 kivételével, amelyeknek eltérő szekvenciája van a fehérje ezen régiójában. A két fennmaradó ADO II mutáció és az ARO mutáció a fehérje citoszolikus, C-terminális részén található, szomszédos aminosavakat érintve. A G765, L766 és R767 a D13 szakaszon belül található, amely egybeesik a CLCN7 fehérjében leírt második CBS (cisztationin-β-szintáz) doménnel (21). Mindhárom mutáció a CBS-domén β2-szálán belül lokalizálódik, amelyben mutációkról már beszámoltak, amelyek emberi betegséget okoznak (22). Ennek a doménnek a pontos funkciója még nem tisztázott, de feltételezik a fehérje szortírozásában betöltött szerepét (21).

Végül a két kis deléció a ClCN7 intracelluláris C-terminális részének aminosavait érinti. Az egyik betegnél deletált L688-as aminosav a két CBS-domén között helyezkedik el, míg a 2423-as nukleotidpozíciótól kezdődő két nukleotid deléciója két nem rokon családban olyan fehérjét eredményez, amely csak az utolsó 10 aminosavban különbözik a vad típusú ClCN7-től.

Megbeszélés

Az emlősökben előforduló oszteopetroszok heterogén betegségcsoportot alkotnak, amely legalább nyolc különböző klinikai entitást foglal magában emberben (2) és körülbelül kilenc spontán állati mutációt (23). Továbbá számos gén knockout egérmodellje okoz osteopetrosis fenotípust, ami az osteoclastok differenciálódásában és aktivációjában szerepet játszó tényezők sokféleségét mutatja (23).

A humán osteopetrosisok heterogenitását a közelmúltban még az ADO II altípuson belüli genetikai heterogenitás is aláhúzta (24,25). Ez a felfedezés egy kiterjedt dán családot érintő linkációs vizsgálaton alapult, amely az ADO II gént az 1p21 kromoszómához rendelte (26). Ezt a hozzárendelést azonban más ADO II családokon végzett vizsgálatok nem erősítették meg. Valójában a közelmúltban végzett, hat ADO II családot érintő linkációs vizsgálatunkban a betegséget okozó gént a 16p13.3 kromoszómán lokalizáltuk, és ugyanebben a dán családban az ADO II és a 16p13.3 kromoszóma haplotípusa közötti kozegregációt találtunk (15). Ezért feltételeztük, hogy az 1p21 kromoszómához való kapcsolódás bizonyítéka ebben a családban véletlenszerű kozegregációt tükröz. Jelen tanulmányban megerősítettük ezt a hipotézist, mivel azonosítottunk egy betegséget okozó mutációt (G215R) a ClCN7 génben ebben a dán családban. Ez, valamint az a tény, hogy ebben a génben mind a 12 elemzett ADO II családban találtak mutációt, arra utal, hogy az ADO II genetikailag homogén.

Eredményeink azt is illusztrálják, hogy az ADO II allélos az osteopetrosis súlyos, autoszomális recesszív, infantilis formájában szenvedő betegek egy alcsoportjával. Korábban egy ARO-beteget a ClCN7 génben egy nonszensz mutáció (Q555X) és egy misszensz mutáció (R762Q) összetett heterozigótájaként írtak le (17). Most egy homozigóta mutációt (L766P) találtunk egy másik ARO-betegnél.

Az 5. ábra szemlélteti a különböző genotípusok és fenotípusok közötti összefüggésünket. Amint azt a ClC-7 knockout egér fenotípusa mutatja, a ClC-7 kloridcsatorna teljes funkcióvesztése súlyos osteopetrosist okoz, ahogyan az ARO betegeknél is megfigyelhető. Mivel a ClCN7 mutációit eddig csak két ARO-betegnél jellemezték, nem lehet tudni, hogy a fenotípusos különbségek tükrözik-e a mutációik természetét. Az osteopetrosis néhány ritka esete “köztes” formát mutat. Ezekben az esetekben autoszomális recesszív öröklődési módot javasolnak, de a fenotípus enyhébb, mint az ARO esetében (7,8). Talán ezek az esetek a ClCN7 két olyan mutációjának kombinációjára vezethetők vissza, amelyek mindegyike csak enyhén csökkenti a Cl- vezetőképességet.

Az itt közölt ADO II mutációk elsősorban konzervált aminosavakat érintő miszense mutációk (3. és 4. ábra). A fennmaradó két mutáció kis deléciók, amelyek szintén megőrzik a kloridcsatorna fő anatómiáját, és ezért valószínűleg a miszense mutációkhoz hasonló hatásokat eredményeznek. Mivel úgy tűnik, hogy a kloridcsatornák multimerekbe, valószínűleg dimerekbe szerveződnek (27), ezek a mutációk valószínűleg domináns negatív hatások miatt károsítják a funkciójukat. Ilyen hatások esetén a legtöbb kloridcsatorna nem fog működni, ami megmagyarázza a fenotípusos eltéréseket.

Általában az ARO-betegek szülei fenotípusosan normálisak. Feltételezzük, hogy ez azt tükrözi, hogy e gén haploinsufficienciája valószínűleg nem okoz klinikai szövődményeket vagy radiológiai leleteket. Alternatívaként ez egyes esetekben az ADO II csökkent penetrációjának is betudható. Az ebben a tanulmányban bemutatott ARO-beteg szüleinél az ADO II klinikai tünetei nem jelentkeztek, de röntgenvizsgálat nem állt rendelkezésre.

Az ADO II és az ARO allelikus jellegét alátámasztja egy ADO II-t szegregáló kiterjedt családról szóló beszámoló, amelyben az egyik egyénben ARO manifesztálódott (28). Talán ebben a családban egy domináns negatív hatású mutáns ClCN7 gén okozza az ADO II-t, amely aztán egybeesik egy de novo mutációval, vagy a második szülőtől örökölt, ARO-t okozó mutációval. Az osteopetrosis ClCN7 mutációkkal összefüggő domináns és recesszív formáinak javasolt magyarázata párhuzamos a myotoniát okozó ClC-1 gén mutációival. A ClC-1 elvesztését eredményező mutációk az autoszomális, recesszív formát (Becker-típus) okozzák (29), míg a miszense mutációk a kevésbé súlyos, autoszomális domináns formával (Thomsen-típus) jelentkeznek (30).

Összefoglalva, kimutattuk, hogy az ADO II legtöbb, ha nem minden esetét a ClCN7 gén mutációi okozzák. A ClCN7 mutációk jellege alapján az ADO II fenotípus valószínűleg domináns negatív hatás eredménye. Eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, hogy a kloridcsatornák általában homomultimerekként viselkednek. Továbbá tanulmányunk illusztrálja az ADO II allelikus jellegét és az ARO esetek egy alcsoportját.

MÓDSZEREK ÉS MÓDSZEREK

Családok és betegek

Az A-F családokat korábban már leírtuk, mivel ezek alapján lokalizáltuk az Albers-Schönberg-kór génjét a 16p13.3 kromoszómán (15). A G-L minták Albers-Schönberg-kóros családok érintett egyedeitől származnak, és több mintát is leírtak már (31-33) (1. táblázat).

Az M család az Egyesült Államokban él, de kínai felmenőkkel rendelkezik. A javasasszony egy egészséges házaspár gyermeke, és teljes terhesség után született. A szülők másodfokú unokatestvérek. ARO-t 3 hónapos korában diagnosztizálták, amikor Bell-bénulással jelentkezett a New York-i Queens-i Kórház Orvosi Központjában. A csontváz röntgenvizsgálata súlyos osteopetrosist és több, nem elmozdult ferde törést mutatott ki. Vérszegénysége, retikulocitózisa, hepatosplenomegáliája és enyhe látóideg-atrófiája volt. A gyermek nem megfelelő allogén csontvelő-átültetésen esett át, de 18 hónapos korában szepszis és légzési elégtelenség következtében meghalt.

Mutációelemzés

A DNS-t standard eljárásokkal izolálták a vérből. A ClCN7 összes kódoló exonját és intron-exon-határait amplifikáló intron-primereket (2. táblázat) genomiális szekvenciákból (GenBank accession nos AL031600 és AL031705) terveztük. A 25 exont genomi DNS-ből Taq-polimerázzal vagy PCR enhancer rendszerrel (Gibco BRL), 1× enhancer koncentrációval amplifikáltuk. Minden amplifikációhoz 30 ciklust végeztünk a 2. táblázatban megadott hőmérsékleten.

A PCR-termékeket Concert Rapid PCR tisztító rendszerrel (Life Technologies) tisztítottuk és közvetlenül szekvenáltuk az amplifikációhoz használt primerekkel, Big-Dye terminátor vegyszerrel (Perkin-Elmer), ABI 3100 automatizált szekvenálóval. A 9. exon amplifikációja változó hosszúságú fragmentumot eredményezett, mivel ez az exon egy 50 bp hosszúságú, változó kópiaszámú tandem ismétlődő szekvenciát követ. A mi mintáinkban a kópiaszám négy és hét ismétlődés között változott. Ez az ismétlődés néhány mintában zavarja ennek az exonnak az előrefelé irányuló szekvenálását is.

Minden olyan exont, amelyben feltételezett mutációkat mutattunk ki, 100 kontrollkromoszómában szekvenáltunk, anélkül, hogy a mutációkat megtaláltuk volna.

HÁTTÉRI KÖSZÖNET

Köszönjük a betegeknek és a családoknak, valamint a klinikusoknak, akik anyagot biztosítottak. Ezt a kutatást egy ösztöndíj támogatta (G.0404.00) a “Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek” (FWO) által W.V.H. A kutatást a “Société Française de Rhumatologie” (SFR), a “Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris” (FERCMHP) és a Shriners Hospital for Children (no. 8540) is támogatta.