Kémiai anyagok és reagensek
AGT-t a tajvani Taichung város piacáról vásároltuk. Az IS-t (tisztaság 97%) az Alfa Aesartól (Lancaster, Egyesült Királyság) szereztük be. A 6,7-dimetoxikumarin (6,7-DMC, tisztaság 98%) az Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) biztosította. Az EC (tisztaság 90%), ECG (tisztaság 98%), EGCG (tisztaság 95%), hangyasav, probenecid, foszforsav (jégsav, 85%) és metil-parabén a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Az EGC-t (tisztaság 92,7%) a ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, USA) és az etil-acetát LC minőségű volt, és az ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Tajvan). Az acetonitril LC/MS minőségű volt, és a Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA). A szarvasmarha magzati szérumot a Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Izrael). Penicillin-Streptomicin-Glutamin, Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, tripszin/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution és 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetánszulfonsav az Invitrogen-től (Carlsbad, CA, USA) származott. A Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12-t a Thermo Fisher Scientific Inc-től (Waltham, MA, USA) szereztük be. A 6-karboxifluoreszceint az AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, USA) és az 5-karboxi-fluoreszceint az Acros Organics-tól (Geel, Belgium) szereztük be. Minden előkészítéshez Milli-Q plus vizet (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) használtunk.
A GT infúzió előállítása és jellemzése
Az infúziót 2 vagy 4 g GT 50 ml forró deionizált vízben (98-100 °C) 30 percig történő áztatásával állítottuk elő. Az infúziót forró állapotban gézzel szűrtük, hogy 40, illetve 80 mg/ml koncentrációt kapjunk, amelyet frissen adtunk be patkányoknak gyomorszájon át.
A GT infúzió jellemzéséhez a GT infúzió 0,2 μm-es RC15 szűrővel (Sartorious, Göttingen, Németország) történő szűrése után 100 μL szűrletet 900 μL metanollal kevertünk és centrifugáltuk a csapadék eltávolítása érdekében. A megfelelően hígított infúziót (50 μL) 50 μL 6,7-DMC oldattal (2,0 μg/ml metanolban) mint belső standarddal egyesítettük, és 5 μL-t LC-MS/MS elemzésnek vetettünk alá. A HPLC-rendszer Accela 1250 pumpát és automatikus mintavevő készüléket (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.) tartalmazott. A kromatográfiás elválasztás Phenomenex® C18 analitikai oszlop (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) és előszűrő segítségével történt. A mozgófázis 0,01% hangyasavat tartalmazó acetonitrilből (A) és 0,01% hangyasavat tartalmazó vízből (B) állt, és az alábbiak szerint gradiens módon programoztuk: A/B: 2/98 (0-2 perc), 15/85 (4 perc), 40/60 (6 perc), 90/10 (8-10 perc) és 2/98 (12 perc). Az áramlási sebesség 0,2 ml/perc volt. Az oszlopkiáramlást H-ESI (heated-electrospray ionization) -II szondával detektáltuk Quantum Access MAX háromfokozatú kvadrupolos (TSQ) tömegspektrométerrel (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Hüvelygázként 35 tetszőleges egységnyi nitrogént, segédgázként pedig 10 tetszőleges egységnyi nitrogént használtunk. Az ütközési energiát -19/18 V-ra, a permetezési feszültséget -3000/3000 V-ra, a kapilláris hőmérsékletet 350 °C-ra, a párologtató hőmérsékletet 350 °C-ra és a csőlencse eltolását -80/88 V-ra állítottuk be. A következő tömegátmeneteket használtuk a kiválasztott reakciófigyelő elemzéshez (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) és 6,7-DMC (207/151). Az ESI-MS spektrumokat az EC, EGC, ECG és EGCG esetében negatív ion módban, a 6,7-DMC esetében pedig pozitív ion módban vettük fel.
Állatok
Hím Sprague-Dawley patkányokat (270-360 g) a Nemzeti Laborállat Központból (Taipei, Tajvan) vásároltunk és 12 órás világos/sötét ciklusban, kondicionált környezetben tartottuk. Élelmet és vizet ad libitum kaptak a kísérleteket megelőző 12 óráig. A patkányokat két csoportra osztottuk. Az első kísérletben 28 patkányt használtunk, hogy meghatározzuk a GT hatását a CRF patkányok IS és PCS szérumszintjére; a második kísérletben 14 patkányt használtunk, hogy értékeljük a GT hatását a CRF patkányok vesefunkciójára. Minden állatkísérletet szigorúan a Kínai Állattudományi Társaság (Taiwan, R.O.C.) által kiadott ”The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)” ajánlásainak megfelelően végeztünk. A kísérleti protokollt a China Medical University, Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Establishment of CRF model and administration of GT infusion
A CRF-et a korábbi tanulmányok alapján, de némi módosítással19,23,35,36, adenin orális beadásával idéztük elő. Röviden, 0,5%-os metilcellulóz 400-ban szuszpendált adenint (15 mg/ml) szájon át adtunk 28 patkánynak gyomornyeléssel naponta kétszer hét egymást követő adagban (15 mg/patkány) a kísérleti időszak alatt. A 4. napon meghatározták az IS szérumszintjét. Miután a szérum IS-szintek jelentős emelkedésével megerősítették a csökkent vesefunkciót, a CRF-patkányokat három csoportra osztották (csoportonként 8-10 patkányt), amelyekben az IS-szintek összehasonlíthatóak voltak. Az első csoport naponta kétszer 400 mg/5 ml/kg GT infúziót kapott hét egymást követő adagban; a második csoport naponta kétszer 200 mg/5 ml/kg GT-t kapott hét egymást követő adagban; a harmadik csoport pedig párhuzamosan 5 ml/kg vizet kapott kontrollként. A 8. napon a patkányoknak az éjszakai koplalás után 9:00 órakor adták be a 7. GT-dózist, és a vérmintákat az adagolás után 0, 15, 30, 60, 120, 180 és 360 perccel vették. A vérvétel és az adenin és a GT beadásának tervezett időpontját a 3. ábra foglalja össze. Minden egyes mintavételi időpontban 0,5 ml vért vettek le izoflurán-anesztéziában. A vérmintákat mikrocsövekbe gyűjtöttük, és 15 percig 10 000 g-nél centrifugáltuk, hogy szérumot nyerjünk, amelyet elemzés előtt -20 °C-on tároltunk.
A szérumban lévő IS és PCS koncentrációjának meghatározása
A szérumban lévő IS és PCS koncentrációjának meghatározásához 50 μL szérummintát 200 μL metanollal, amely 10 μg/ml 6,7-DMC-t, illetve 100 μg/ml metilparabént mint belső standardot tartalmazott, vortexeltünk, majd a csapadék eltávolítása érdekében centrifugáltuk, majd egy 20 μL-es aliquotot HPLC analízisnek vetettünk alá.
A kalibrátor készítményekhez 50 μL szérumot az IS és a PCS különböző koncentrációival spicceltünk, hogy 0,4-25,0 μg/ml (1,8-117,3 μM), illetve 0,3-20,0 μg/ml (1,7-106,3 μM) koncentrációtartományt biztosítsunk. A későbbi eljárás követte a szérumminták esetében fent leírt eljárást. A kalibrációs görbéket a csúcsterület-arányok (IS vagy PCS és belső standard) lineáris regressziójával rajzoltuk meg az IS, illetve a PCS ismert koncentrációi ellenében.
A HPLC-készülék tartalmazott egy pumpát (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japán), fluoreszcens detektort (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japán) és automatikus injektort (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japán). Az Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) oszlopot védőoszloppal (4,6 × 50 mm, 5 μm) láttuk el (GL Science Inc., Tokió, Japán). A mobil fázis acetonitril (A)-0,1% foszforsav (B) volt, és gradiens módon programoztuk a következőképpen: A/B: 15/85 (0-7 perc), 30/70 (9-22 perc) és 15/85 (24-35 perc) az IS és 16/84 (0-10 perc), 30/70 (13-22 perc) és 16/84 (24-36 perc) a PCS esetében. A detektor beállításai Ex 280 nm/Em 375 nm voltak az IS esetében és Ex 214 nm/Em 306 nm a PCS esetében. Az áramlási sebesség 1,0 ml/perc volt.
A GT hatása a Cr-re és a BUN-ra CRF patkányokban
Egy másik kísérletben a fent említett állatprotokollt alkalmaztuk, és a Cr és a BUN koncentrációját az adenin kezelés előtt (0. nap), a GT adagolása előtt (4. nap) és a 7. GT adag után (8. nap) határoztuk meg. Miután a 4. napon a Cr és a BUN jelentős emelkedésével megerősítették a vesefunkció gyengülését, a CRF-patkányokat két csoportra osztották (csoportonként 7 patkányt), amelyek Cr-szintje összehasonlítható volt. Az első csoport naponta kétszer 400 mg/5 ml/kg GT-t kapott hét egymást követő adagban; a második csoport kontrollként párhuzamosan 5 ml/kg vizet kapott. A 8. napon a patkányoknak az éjszakai koplalás után beadták a 7. adag GT-t és vizet, és a vérmintákat 30 perccel később vették. A Cr-t kinetikus alkalikus pikrát módszerrel határoztuk meg ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.) készülékben. A BUN-t az ureáz/glutamát-dehidrogenáz kapcsolt enzimreakcióval határozták meg ugyanezzel az analizátorral.
Cellavonalak és tenyésztési körülmények
A transzportvizsgálatokhoz használt stabilan transzfektált sejtvonalak, a hOAT1-et expresszáló kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek (CHO-hOAT1), a hOAT3-at expresszáló humán embrionális vese 293 (HEK) sejtek (HEK-hOAT3) és a megfelelő üres vektorral transzfektált kontroll sejtvonalak előállítását korábban leírtuk40,41 . A CHO sejteket 37 °C-on, 5% CO2 mellett DMEM F-12 médiában (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) tartottuk, amely 10% szérumot, 1% penicillint/streptomycint és 1 mg/ml G418-at tartalmazott. A HEK sejteket 37 °C-on, 5% CO2 mellett tartottuk DMEM magas glükóz tartalmú tápfolyadékban (Thermo Fisher Scientific Inc, USA), amely 10% szérumot, 1% penicillint/streptomycint és 50 μg/ml hygromycin B-t tartalmazott. A sejteket Poly-D-Lysin bevonatú edényekben tenyésztettük.
A GT szérum metabolitjainak (GTM)
Az OAT-okkal in vivo kölcsönhatásba lépő molekulák utánzása érdekében patkányokból GTM-et állítottunk elő és jellemeztük. Röviden, GT infúziót (800 mg/10 ml/kg) szájon át adtak be éjszakára koplaltatott patkányoknak. A GT-infúzió adagolása után 15 perccel vért vettünk. Alvadás után a szérumot összegyűjtöttük és 3-szoros metanollal vortexeltük. A 15 percig tartó, 10 000 g-n végzett centrifugálást követően a felülúszót rotációs elpárologtatóban, vákuum alatt szárazra koncentráltuk. A maradékhoz megfelelő mennyiségű vizet adtunk, így 10-szeres szérumkoncentrációjú oldatot kaptunk, amelyet aliquotokra osztottunk és -80 °C-on tároltunk későbbi felhasználásra.
A GTM egy részét egy korábbi módszer szerint, némi módosítással16,46 jellemeztük. Röviden, 100 μL szérummintát 50 μL szulfatázzal (amely 1000 egység/ml szulfatázt és 39 861 egység/ml ß-glükuronidázt tartalmazott), 50 μL aszkorbinsavval (200 mg/ml) kevertünk, és 37 °C-on 45 percig inkubáltuk anaerob körülmények között. A hidrolízis után a szérumot 50 μL 0,1 N HCl-hez adtuk, majd 250 μL etil-acetáttal (amely 100 ng/ml 6,7-DMC-t tartalmazott belső standardként) elválasztottuk. Az etil-acetát réteget N2 alatt szárazra pároltuk, és az LC-MS/MS elemzés előtt megfelelő mennyiségű mozgófázissal visszaállítottuk. A mobilfázis acetonitril (A) – 0,1% hangyasavat tartalmazó víz (B) keverékéből állt, és az alábbiak szerint gradiens módon programoztuk: A/B: 2/98 (0-2 perc), 15/85 (4 perc), 40/60 (6 perc), 90/10 (8-10 perc) és 2/98 (12 perc). Az áramlási sebesség 0,2 ml/perc volt.
A GTM hatása a hOAT1 és hOAT3 által közvetített felvételi transzportra
CHO-hOAT1 és HEK-hOAT3 sejteket (1 × 105 sejt/lyuk) 96 lyukú lemezben tenyésztettünk. A GTM-nek a hOAT1 és a hOAT3 aktivitására gyakorolt hatásának értékelésére 6-karboxi-fluoreszcein (6-CF) és 5-karboxi-fluoreszcein (5-CF) szondákat használtunk47,48 . Ezenkívül probenecidet (80 μM) használtunk pozitív kontrollként a hOAT1 és hOAT349 gátlására. A CHO-hOAT1 vagy HEK-hOAT3 24 órás vagy 48 órás inkubálása után a tápfolyadékot eltávolítottuk és háromszor mostuk PBS pufferrel. A transzportkísérlet előtt a CHO-hOAT1 és HEK-hOAT3 sejteket 37 °C-on előinkubáltuk a vizsgált hatóanyagokkal (GTM és probenecid). A 30 perces inkubációt követően 6-CF-et vagy 5-CF-et adtunk hozzá, majd további 5 percig, illetve 10 percig inkubáltuk. A lemezeket azonnal jégfürdőre helyeztük, a felülúszókat eltávolítottuk, és a sejteket háromszor mostuk jéghideg PBS-szel. Ezt követően 100 μL 0,1%-os Triton X-100-at adtunk a sejtek líziséhez, majd a fluoreszcenciát 485 nm-es gerjesztéssel és 528 nm-es emisszióval mértük. Az egyes lyukak fehérjetartalmának mennyiségi meghatározásához 10 μL sejtlizátumot adtunk 200 μL hígított protein assay reagenshez (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.), és az optikai sűrűséget 570 nm-en mértük. A 6-CF vagy 5-CF relatív intracelluláris felhalmozódását a fehérjekorrekciót követően a kontrollokéval összehasonlítva számoltuk ki.
Adatelemzés
A szérum csúcskoncentrációt (Cmax) kísérleti megfigyelésből kaptuk. A szérumkoncentráció – idő görbe alatti területet (AUC0-t) a trapézszabály segítségével számoltuk ki az utolsó pontig. Az IS és a PCS három csoport közötti különbségeit egyirányú ANOVA segítségével elemeztük, míg a Cr és a BUN két csoport közötti különbségét párosítatlan Student’s t-próbával elemeztük, p < 0,05 szignifikáns szintnek tekintve. Párosítás nélküli Student’s t-próbát használtunk az in vitro vizsgálatok elemzéséhez is.