Abstract
A Xiao-Yao-San (XYS) főzet egy hagyományos kínai gyógyászati formula. A tanulmány célja a XYS kognitív képességekre gyakorolt hatásának és a mögöttes mechanizmusnak a vizsgálata volt ovariektomizált patkányokban. Nőstény Sprague-Dawley patkányokat ovariektomizáltak és XYS-szal (3 g/kg vagy 9 g/kg) kezeltek fecskendezéssel, 17-β ösztradiol (E2, 2 μg/kg) szubkután injekciójával mint pozitív gyógyszerkontrollal és 1 ml sóoldat (0,9%) fecskendezésével mint placebokontrollal. A 6 hetes kezelés után a patkányokat a Morris-vízlabirintus teszt segítségével vizsgálták. Az ösztradiolszintet a szérumban és a hippokampuszban ELISA-val mértük. Golgi festést végeztünk a neuronális morfológia megfigyelésére a hippokampuszban. A hippokampusz sejtjeinek apoptózisát TUNEL-festéssel figyeltük meg. Az N-metil-D-aszpartát receptor (NMDAR) 2A és 2B fehérjetartalmát a hippokampusz CA1 régiójában Western blot és immunhisztokémia segítségével határoztuk meg. Az ösztrogénreceptor (ER) és a PI3K jelátvitel expresszióját Western blot segítségével mutattuk ki. A látszatcsoporttal összehasonlítva mind a tanulás, mind a memória károsodott az ovariektomizált patkányoknál. Az E2-vel vagy nagy dózisú XYS-szel kezelt patkányok jobb tanulást és memóriát mutattak a sóoldattal kezelt patkányokhoz képest. A nagy dózisú XYS szignifikánsan csökkentette a menekülési latenciát a térbeli elsajátítási kísérletben; eközben a térbeli szondakísérletben megnőtt a keresztidő és az időtartam a szondakvadránsban. A nagy dózisú XYS elősegítette az E2-tartalom de novo szintézisét a hippokampuszban, de nem volt jelentős hatása a szérum E2-szintre. A Golgi-festés azt jelezte, hogy a nagy dózisú XYS növelni tudta a hippokampusz CA1 területén a dendritikus tüskék elágazásszámát és sűrűségét. A TUNEL-festés azt mutatta, hogy a nagy dózisú XYS enyhítette az ovariektómia által kiváltott neuronális apoptózist. Az NMDAR2A és NMDAR2B expressziós szintjét a hippokampusz CA1 területén a XYS-kezelés felszabályozta. A XYS kedvező hatása az ERα-PI3K jelátvitel aktiválásán keresztül érvényesült. Összefoglalva, a nagy dózisú XYS kezelés javíthatja az ovariektomizált patkányok kognitív képességeit a hippokampusz neuronjainak védelme és a hippokampusz E2 szintjének helyreállítása révén.
1. Bevezetés
A perimenopauzában lévő nők gyakran szenvednek az ösztrogénszint ingadozásával összefüggő szorongástól és depressziótól . A szorongás és a depresszió mellett a perimenopauzában lévő nők másik gyakori panasza a feledékenység. A Seattle Midlife Women’s Health Study arról számolt be, hogy a középkorú nők 60%-a észlelte a memória romlását . A Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) megállapította, hogy a perimenopauza a középkorú nők önbevalláson alapuló feledékenységének függő kockázati tényezője volt . Mivel az agy az ösztrogénszabályozás fontos célpontja, feltételezik, hogy az ösztrogénhiány lehet felelős a kognitív károsodásért. A kognícióra gyakorolt hatásról szóló megfigyeléses vizsgálatok eredményei azonban nem teljesen következetesek . Ráadásul a kognitív teljesítményt javító hatékony terápiás hormonális beavatkozásokat még nem sikerült megállapítani . Ezenkívül más tényezők, például az észlelt stressz, a hangulat és a fizikai egészségi állapot is hozzájárulhatnak a memóriatünetekhez . A petefészek ösztrogéntermelés nagyobb valószínűséggel befolyásolja a memóriát a hirtelen csökkenés, mint a természetes átmenet esetén . A humán vizsgálatok ellentmondásosságával ellentétben az ovariektomizált állatokon végzett vizsgálatok eredményei alátámasztják az ösztrogénhiány és a kognitív változások összefüggését és a hormonpótló terápia hatékonyságát .
A fitoösztrogénekkel való kiegészítés népszerű alternatív terápia a menopauza tüneteinek enyhítésére . A fitoösztrogének, mint például a flavonoidok, izoflavonok és lignánok, a szteroid ösztrogénekhez hasonló szerkezetűek, és az ösztrogénreceptorok (ER) aktiválásával ösztrogénszerű szerepet játszhatnak. Egy metaanalízis alátámasztotta a szójaizoflavon-kiegészítés hatékonyságát a vizuális memória javításában egészséges posztmenopauzás nőknél . A SWAN Phytoestrogen Ancillary Study kimutatta, hogy a magas izoflavon- vagy ligninbevitel javíthatja a feldolgozási sebességet vagy a verbális memóriát a menopauza egy bizonyos szakaszában, bár az előny etnikai/faji hovatartozással is összefüggött . A fitoösztrogének kogníciót javító hatását egyértelműbben jelzik az állatkísérletek. A görögszénamagból származó hidroalkoholos kivonat enyhíthette az ovariektómia- (OVX-) indukálta hippokampusz neuron károsodást és javíthatta a tanulási és memória teljesítményt egy patkány modellben .
Xiao-Yao-San (XYS), ami kínaiul boldog és gondtalan port jelent, egy hagyományos kínai gyógyászati formula (TCM), amelyet a klimaxos szorongás és depresszió kezelésére használnak. A formula Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizom macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe) és Glycyrrhizae radix (Gancao) összetevőkből áll. Egy 26 randomizált vizsgálatot tartalmazó szisztematikus elemzés kimutatta, hogy a XYS jobb volt az antidepresszánsoknál, amit a Hamilton depressziós skála pontszámai jeleztek, és fokozhatta az antidepresszánsok hatékonyságát az önértékelő depressziós skála pontszámainak javításában. A perimenopauzában lévő, exophthalmiában és palpitációban szenvedő nők is profitálhatnak a XYS-kezelésből . A XYS egyes terápiás hatásai a menopauzaszindróma enyhítésére a fitoösztrogének jelenlétének tulajdoníthatók. Számos tanulmány számolt be a fitoösztrogének jelenlétéről a XYS-ben. Ergoszterol található a Poria cocosban (Fuling) , és β-szitoszterol ismert az Angelicae radixban (Danggui) . Miller-Marini és munkatársai kifejlesztettek egy ösztrogén-kimerikus receptor/Gal4-válaszelem szabályozott/luciferáz-reporter tesztet a fitoösztrogének jelenlétének kimutatására komplex TCM-formulákban. Elemezték a Bupleurum & Peony Formula-t, a XYS módosított formuláját ugyanazokkal a fő gyógynövényekkel, és mérhető fitoösztrogéntartalmat találtak .
A fitoösztrogének jelenléte a XYS-ben arra utal, hogy a XYS alkalmas az ösztrogénhiány okozta kognitív károsodás kezelésére. Egy állatkísérlet kimutatta, hogy a XYS képes enyhíteni a krónikus immobilizációs stressz (CIS) által kiváltott tanulási és memóriadeficitet . Jelenleg egyetlen tanulmány sem értékelte a XYS hatását a perimenopauzában lévő nők kognitív károsodásának javítására. Ezért a jelen tanulmányban a XYS kognitív képességekre gyakorolt hatását és a mögöttes mechanizmust vizsgáltuk OVX patkányokban.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Állatok és kezelés
A vizsgálatban összesen 60 nőstény Sprague-Dawley patkányt használtunk. A vizsgálati protokollt a Kísérleti Állatok Intézeti Etikai Bizottsága hagyta jóvá (jóváhagyási szám: ACU170802). Az állatokat szabadon hozzáférhető vízzel és standard étrenddel tartották, ellenőrzött hőmérséklet és páratartalom mellett. A patkányokat véletlenszerűen 5 csoportra osztottuk (12 patkány/csoport): látszatcsoport, OVX + sóoldat vagy O-sóoldat csoport, OVX + 17-β ösztradiol (E2) vagy O-E2 csoport, OVX + XYS 9 g/kg vagy O-XYS9 csoport, és OVX + XYS 3 g/kg vagy O-XYS3 csoport. A patkányok OVX műtétet végeztek altatásban, a fent leírtak szerint. Röviden, a törzs egyharmadán és a gerinc mindkét oldalától 1-2 cm távolságra hosszanti bemetszést ejtettek. A zsírszövetet csipesszel óvatosan kihúztuk. A petefészket azonosították, és a méhszarvakat lekötötték. A petefészket eltávolították, és a hasi bemetszést összevarrták. A látszatcsoportban a hasi bemetszést OVX nélkül végezték.
A kezelést két héttel az OVX műtét után kezdték el, és hat hétig tartott. A XYS kezelési csoportokban a patkányok XYS-t kaptak fecskendőtűvel, napi egyszeri 9 g/kg vagy 3 g/kg dózisban. Pozitív gyógyszerkontrollként E2 szubkután injekciót (2 μg/kg) állítottunk be. Placebokontrollként 1 ml sóoldatot (0,9%) adtak be. A XYS főzetet kivonat formájában használtuk (1 g/ml, ami 1 g nyers gyógynövénynek/ml-nek felel meg), amelyet a Nanjingi Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem kapcsolt kórháza biztosított. A XYS főzet képletét drágán jelentették. A klinikán a perimenopauzában lévő nőknél alkalmazott XYS adagja 175 g nyers gyógynövény/60 kg, ami patkányoknál 3,5 g/kg-nak felel meg. A patkánymodellről szóló más kísérleti jelentésekre hivatkozva az alacsony dózist 3 g/kg-ban, a magas dózist pedig 9 g/kg-ban határoztuk meg . Az E2 port (Cat. no. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kis mennyiségű etanolban oldottuk, majd 20 μg/ml törzsoldatot készítettünk 0,9%-os sóoldattal.
2.2. Morris-vízlabirintus teszt
A patkányok tanulási és memóriafunkcióit a Morris-vízlabirintus (MWM) teszt segítségével vizsgáltuk . Az MWM kísérleti eszköz egy kerek medence (200 cm átmérőjű) 38-40 cm magas vízzel. A víz hőmérsékletét állandóan 20-22°C-on tartottuk. A WMW-teszt három részből áll, nevezetesen a térbeli elsajátítási kísérletből (amely 5 napig tart), a térbeli szondás kísérletből és a látható platform kísérletből. A térbeli elsajátítási kísérletben a patkányokat óvatosan a víztartály egy véletlenszerű kvadránsába helyeztük úgy, hogy a platformot 1,5 cm-re az északkeleti kvadránsban a víz alá rejtettük. Minden patkánynak legfeljebb 60 másodpercig engedtük, hogy ússzon, hogy megtalálja a platformot. Azokat a patkányokat, amelyek 60 s alatt nem találták meg a platformot, odairányítottuk, és a latenciát 60 s-ban rögzítettük. A menekülési latenciát egy videóelemző rendszer (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA) rögzítette. A patkányokat naponta 4 alkalommal edzettük. Az 5 napos tréning után a patkányok megkapták a térbeli szondapróbát úgy, hogy a platformot eltávolították az északkeleti kvadránsból. A patkányokat ugyanarra a kiindulási helyre, az északnyugati kvadránsba helyezték. A platformot 120 s alatt kereső patkányok utazási nyomvonalát rögzítettük. A térbeli memória megtartásának értékeléséhez kiszámítottuk a célkvadránsban töltött időtartamot és a keresztezési időket. A térbeli próbát követő következő napon a patkányok a rejtett platform tréninghez hasonló látható platform próbát kaptak, amelyben a platformot 1,5 cm-rel a vízfelszín fölé emelték, és a délnyugati kvadránsban helyezték el. Minden patkányt 4 alkalommal engedtünk szabadon, és minden alkalommal más-más belépési pontról. A menekülési késleltetést, az úszási távolságot és az úszási sebességet rögzítettük.
2.3. Mintavétel
Az MWM teszt befejezése után a patkányokat thoracotomizáltuk és a bal kamrán keresztül a felszálló aortába intubáltuk nátrium-pentobarbitállal (40 mg/kg intraperitoneális injekcióval) történő altatásban. A törzsi vért szérumleválasztó csővel gyűjtöttük az E2 kimutatásához. Hat patkány hippocampiját elválasztottuk az agykéregtől és a környező agyszövetektől, gyorsan eltávolítottuk, hideg PBS-szel mostuk, és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk az E2 kimutatásához és a Western blothoz. Három nem perfundált agyszövetet 24 órán át 4%-os paraformaldehidben immobilizáltunk, majd Golgi-festéshez és immunhisztokémiához használtuk. A bal oldali három patkányt transzkardiálisan perfundáltuk hideg sóoldattal, majd 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk 1 órán keresztül. Ezután az agyakat eltávolítottuk, 4%-os paraformaldehidben 24 órán keresztül fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk a TUNEL-festéshez.
2.4. E2 kimutatása
A vérmintákat szobahőmérsékleten hagytuk alvadni, majd 15 percig 4°C-on centrifugáltuk a szérum elkülönítéséhez. A hippokampusz szöveteket megmértük, hideg sóoldatban homogenizáltuk, és 20 percig centrifugáltuk a felülúszó összegyűjtéséhez. A szérum és a hippokampusz homogenizált felülúszójának E2-tartalmát ELISA kit (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kína) segítségével mutattuk ki.
2.5. Golgi festés
A hippokampuszt kis blokkokra vágtuk és a Golgi festéshez a leírtak szerint dolgoztuk fel . Röviden, a hippokampusz blokkokat 14 napig Golgi festőoldatba (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Kína) merítettük, amely során a festékoldatot 2-3 naponta cseréltük. A szöveteket 30%-os szacharózzal dehidratáltuk és 100 μm-es metszeteket készítettünk. A metszeteket etanolos dehidratálással dolgoztuk fel, xilollal tisztítottuk, és zselatinnal bevont tárgylemezekre rögzítettük. A Golgi-festést minden mintában sikeresen elvégeztük. A hippokampuszban lévő neuronok morfológiáját fénymikroszkóp alatt (Nikon, Tokió, Japán) figyeltük meg. A hippokampusz CA1 régiójában lévő neuronokat az Image J szoftver Neuron J csatlakozójával elemeztük. Minden egyes patkány esetében öt metszetet választottunk ki, és minden egyes metszetből a teljes morfológiájú dendritikus tüskéket választottuk ki . A dendritikus tüskék sűrűségét és elágazási pontjait megmértük.
2.6. Immunhisztokémia
A hippokampuszban az N-metil-D-aszpartát receptor (NMDAR) 2A és 2B alegységeinek expresszióját immunhisztokémiával határoztuk meg a standard eljárás szerint . A felhasznált primer antitestek nyúl anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Kína) és nyúl anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Kína) voltak. A másodlagos ellenanyag HRP-konjugált anti nyúl IgG (Servicebio) volt.
2.7. TUNEL festés
A hippokampusz morfológiai változásait TUNEL festéssel detektáltuk egy kereskedelmi kit (Roche, Mannheim, Németország) segítségével, az utasításoknak megfelelően. A metszeteken DAB kolorimetriás reakciót követően hematoxilin festést végeztünk. A TUNEL-pozitív apoptotikus sejtek sejtmagja fénymikroszkóp alatt barna volt. Minden patkányból öt metszetet választottunk ki, és minden metszetből három nem ismétlődő mezőt (400x nagyítás) választottunk ki. Kiszámítottuk a TUNEL-pozitív sejtek százalékos arányát az összes sejtben.
2,8. Western Blot
A hippokampusz CA1 agyi részét gyorsan kivontuk és az agyatlasznak megfelelően kis szelvényekre vágtuk. A hippokampusz szöveteket egy éjszakán át RIPA lízispufferrel (amely 100 Mm PMSF-et tartalmazott, a Servicebio-tól vásárolt) inkubáltuk. A sejttörmeléket 10 percig tartó centrifugálással távolítottuk el, hogy összegyűjtsük a fehérjetartalmú felülúszót. A fehérjekoncentrációt BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA) segítségével határoztuk meg. A fehérje lizátumokat (30 μg/sáv) 10%-os SDS-PAGE segítségével elválasztottuk és PVDF membránra elektroblottoltuk. Miután 5%-os zsírmentes tejjel blokkoltuk, a membránt egy éjszakán át a következő primer antitestekkel szondáztuk: nyúl anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), nyúl anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), nyúl anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), nyúl anti-ERα (1 : 2000, Millipore), nyúl anti-foszfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), nyúl anti-foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), nyúl anti-Bax (1 : 1000, Abcam), nyúl anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) és nyúl anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). A GAPDH-t belső kontrollként mutattuk ki. Ezután a membránt másodlagos torma-peroxidáz (HRP) konjugált kecske antinyúl IgG-vel (1 : 5000, Bioworld) szondáztuk 1,5 órán keresztül. A sávokat kemilumineszcens módszerrel vizualizáltuk. A fehérjesávok átlagos optikai sűrűségét az Image J szoftverrel számszerűsítettük.
2.9. Statisztikai elemzés
A kísérleti adatokat GraphPad Prism 5 szoftverrel (San Diego, CA, USA) elemeztük. A numerikus adatokat átlag ± SD-ben fejeztük ki. A két csoport közötti különbséget t-próbával hasonlítottuk össze. A rejtett platform kísérlet eredményeit csoport × nap ismétlődő mérések ANOVA-val elemeztük, amelyet Tukey’s post hoc követett. A többi többszörös összehasonlítást egyutas ANOVA-val elemeztük, amelyet Tukey post hoc követett. < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
3. Eredmények
3.1. Eredmények
3. A Xiao-Yao-San főzet javítja az ovariektomizált patkányok térbeli tanulási és memória képességeit
A tanulási képességet először a térbeli elsajátítási kísérlet segítségével vizsgáltuk. Az ismételt mérésekkel végzett ANOVA azt mutatta, hogy mind a kezelés, mind a képzési napok befolyásolták a menekülési késleltetést (1. ábra (a)). A menekülési latencia minden csoportban csökkent a tréningnapok számának növekedésével (), és a különbség az egyes csoportokon belül is szignifikáns volt a latencia csökkenésének tendenciájában (). A kezelés és a tréningnapok között nem volt kölcsönhatás (). A tréning első két napja alatt nem volt szignifikáns különbség az egyes csoportok menekülési latenciájában. A tréning harmadik napjától kezdve a menekülési latencia szignifikánsan hosszabb volt, mint a látszatcsoporté; az E2 és a nagy dózisú XYS9 csoport menekülési latenciája rövidebb volt, mint a sóoldatos csoporté, de nem különbözött a látszatcsoportétól. Az 5 napos tréning után a patkányokat szondás próbával értékelték a térbeli memória tesztelésére. Amint az 1(b) ábrán látható, a keresztidők, az időtartam ideje és az időtartam idejének százalékos aránya a szondakvadránsban szignifikánsan csökkent a sóoldatos csoportban. A többi kvadránsban az időtartam-időben nem volt különbség. Az XYS vagy E2 kezelés szignifikánsan vissza tudta állítani a keresztidőket és az időtartamot a szondakvadránsban a látszatcsoport szintjére. Annak érdekében, hogy kizárjuk a környezeti tényezők, valamint a kísérleti állatok kognitív és aktivitási szintjének hatását a térbeli tanulásra és memóriára, a patkányok a látható platformpróbán is részt vettek (1. ábra c)). A csoportok között nem volt szignifikáns különbség a menekülési késleltetésben, az úszási távolságban és az úszási sebességben. Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a térbeli tanulás és a memória károsodott az OVX patkányoknál, és a nagy dózisú XYS kezelés hatékonyan javíthatta a károsodott kognitív funkciókat.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.2. A Xiao-Yao-San főzet növeli a hippokampusz ösztrogéntartalmát Ovariektomizált patkányokban
A következőkben megvizsgáltuk a XYS hatását az OVX patkányok ösztrogénszintjére. Amint az a) ábrán látható, a XYS kezelés nem javította az OVX miatt csökkent szérum ösztradiolszintet; azonban nem volt szignifikáns különbség a szérum ösztradiolszintben a látszat és OVX kezelési csoportok között. Megjegyzendő, hogy a nagy dózisú XYS és az E2 növelte a hippokampusz ösztradiolszintjét a sóoldathoz képest (2(b) ábra). Az O-XYS3 csoportban még mindig alacsonyabb volt a hippokampusz ösztradiolszintje, mint a látszatcsoportban. A hippokampusz E2-tartalmának változása nem a gonádból származó E2-tartalom változásával, hanem az in situ szintézis változásával magyarázható. Ezért kimutattuk az ösztrogénszintézis végső enzimének, a CYP19-nek az expresszióját a hippokampuszban. Az eredmények azt mutatták, hogy a XYS- vagy E2-kezelés növelni tudta a CYP19 expresszióját a sóoldatos csoporthoz képest (), de csak a nagy dózisú XYS és a sóoldatos csoport közötti különbség volt szignifikáns (). A kezelés nem állította vissza a CYP19 szintjét a látszatcsoportéra. Az eredmények arra utalnak, hogy a XYS elősegítette az aromatáz expresszióját a hippokampuszban, ezáltal növelve az E2 de novo szintézisét.
(a)
(b)
(c)
(d)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
3.3. Xiao-Yao-San főzet csökkenti a neuronális károsodást az Ovariektomizált patkányok hippokampuszában
A hippokampusz sejtmorfológiája, különösen a CA1 régióban, fontos szerepet játszik a kognitív képességekben . A sejtmorfológiát a hippokampuszban Golgi festéssel elemeztük, amint az a 3. a) ábrán látható. A látszatcsoporttal összehasonlítva a sóoldatos csoportban a neuronok száma jelentősen csökkent, és a dendritikus gerincek morfológiája sérült. A CA1 neuronok további elemzése azt mutatta, hogy a neuronok pontszáma és a dendritikus gerincek sűrűsége jelentősen csökkent a sóoldatos csoportban (3(b) és 3(c) ábra). A nagy dózisú XYS-kezelés növelte a neuronok számát a hippokampuszban, és növelte a neuronok pontszerű számát és a gerincek sűrűségét a CA1 régióban. Az E2-kezelésnek ugyanolyan terápiás hatása volt, mint a nagy dózisú XYS-nek. Az alacsony dózisú XYS azonban nem javította hatékonyan a hippokampusz CA1 régiójának neuronális károsodását. Következetesen a hippokampusz (CA1, CA3, DG) neuronjainak apoptózisát csökkentette a nagy dózisú XYS vagy E2 kezelés (4. ábra). Az alacsony dózisú XYS azonban csak a CA3 neuronok apoptózisát tudta csökkenteni, de a CA1 és DG neuronokra nem volt hatása. Összességében a nagy dózisú XYS csökkenteni tudta a neuronális károsodást a hippokampuszban, különösen a CA1 régióban.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Xiao-Yao-San főzet növeli az NMDAR2A és NMDAR2B hippokampális expresszióját ovariektomizált patkányokban.
A szinaptikus plaszticitás a hosszú távú tanulás és memória neurobiológiai alapja, és az MWM tesztben nyújtott teljesítményt befolyásolja az NMDAR funkció . Ezért tovább becsültük az NMDAR 2A és 2B alegységek expresszióját a hippokampusz CA1-ben. A Western blot (5(a) és 5(b) ábra) azt mutatta, hogy az NMDAR2A és NMDAR2B expressziója csökkent az OVX patkányokban. A XYS vagy E2 kezelés jelentősen megnövelte e két fehérje expressziós szintjét a látszatcsoportéval megegyező szintre. Az immunhisztokémia (5. ábra (c)) szintén azt mutatta, hogy a pozitívan festett sejtek aránya nőtt a kezelési csoportokban. A sóoldatos csoporttal összehasonlítva a nagy dózisú XYS szignifikánsan növelte mind az NMDAR2A, mind az NDMAR2B expresszióját ( és 0,013, illetve), de az alacsony dózisú XYS csak az NMDAR2A expresszióját tudta szignifikánsan növelni ().
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.4. A Xiao-Yao-San főzet aktiválja a PI3K jelátviteli útvonalat az ERα-n keresztül
Az E2 vagy a fitoösztrogének élettani hatását az ER jelátvitel közvetíti. Tanulmányok kimutatták, hogy az extracelluláris jel-szabályozott kináz (ERK), egy mitogén-aktivált fehérje kináz aktiválása szükséges az E2 memóriára gyakorolt kedvező hatásaihoz . Az ERK1/2 foszforilációja a PI3K aktivációjától függ . Ezért megvizsgáltuk a XYS hatását az ER-PI3K jelátvitelre. Amint az a 6. ábrán látható, a nagy dózisú XYS és az E2 jelentősen elősegítette az ERα, a foszforilált ERα (Ser118) és a PI3K p110β (a katalitikus alegység) expresszióját a sóoldatos csoporthoz képest. Az ERα-PI3K aktiválása tovább csökkentette a Bax proapoptotikus faktor expresszióját, és fokozta a Bcl-2 antiapoptotikus faktor expresszióját. Az alacsony dózisú XYS azonban nem befolyásolta jelentősen az ERα-PI3K jelátvitelt, ami összhangban van a 3. és 4. ábra eredményeivel.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Megbeszélés
A XYS-t régóta alkalmazzák perimenopauzális szorongás és depresszió kezelésére. Tanulmányunk a XYS új alkalmazását vizsgálta az OVX által kiváltott kognitív károsodás kezelésében. Az eredmények azt mutatták, hogy a XYS hatékonyan javította a térbeli tanulást és a térbeli memóriát OVX patkányoknál. A lehetséges mechanizmus az, hogy a XYS elősegíti az ösztrogén de novo szintézisét a hippokampuszban, ezáltal aktiválja az ERα-PI3K jelátviteli útvonalat és gátolja a hippokampusz neuronjainak apoptózisát.
A depresszió kezelésére szolgáló XYS mögöttes mechanizmusát széles körben tanulmányozták. A XYS antidepresszáns szerepet játszik egy átfogó hálózat szabályozásával, amely magában foglalja a neurotranszmittereket, neurotrofinokat, hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt, aminosavakat és lipideket . E tanulmányok némelyike kimutatta, hogy a XYS képes hatni a stresszel kapcsolatos agyi változásokra. In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy egy XYS-tartalmú szérum képes visszafordítani a mitokondriális membránpotenciál, a szabad kalcium koncentráció és a neuronok oxidatív stressz által kiváltott apoptotikus rátájának változását . Vizsgálatunk azt mutatta, hogy a XYS az OVX patkányok hippokampusz régiójában a neuronális apoptózist is mérsékelte. A XYS antiapoptotikus hatásai arra utalnak, hogy a XYS potenciálisan képes az agyi neuronális apoptózissal kapcsolatos számos patológiás folyamatra hatni.
A vizsgálatunk eredményei azt mutatták, hogy a XYS képes helyreállítani az ösztrogénszintet az OVX patkányok hippokampuszában. A hippokampusz alapvető fontosságú a memóriaképzéshez, és gazdag ER-ekben, és az ösztrogén elősegíti a magasabb kognitív és szinaptikus egészséget ezeken az ER-eken keresztül . Számos klinikai vizsgálat jelezte a hormonpótló terápia hatékonyságát a nők ösztrogénvesztésével kapcsolatos kognitív tünetekre . Az XYS növelheti az ösztradiolszintet a hippokampuszban, ami az OVX-patkányok kognitív képességeinek javításában való hatékonyságának döntő alapja lehet. A XYS azonban nem növelte a szérum ösztradiolszintet. Ennek az lehet az oka, hogy az ösztradiol de novo szintetizálható a hippokampuszban, míg a szérumösztradiol a gonádokból származik . Eredményeink azt mutatták, hogy a XYS növelte a CYP19 expresszióját a hippokampuszban, ami arra utal, hogy a megnövekedett E2 az agyban valószínűleg a hippokampuszból származik . Vizsgálatunk eredményei azt mutatták, hogy a XYS felszabályozta az NMDAR2A és NMDAR2B expresszióját az OVX patkányok hippokampuszában. Ez a megállapítás összhangban volt a korábbi tanulmányokkal. Az ösztrogén az OVX patkányok NMDAR funkcióinak modulálásán keresztül növelte mind a dendritikus gerincek sűrűségét, mind a szinapszisok számát a hippokampuszban . Az ösztrogén a hippokampusz neuronok morfológiáját is helyreállíthatja az idős patkányokban az NMDAR2B szintjének visszaállításával a CA1 régióban a fiatal szinthez képest; mi több, az ösztrogén befolyásolhatja az NMDAR2A és az NMDAR2B mobilitását a szinapszison keresztül . Az NMDAR aktiválása viszont hozzájárulhat a hippokampális E2 szintéziséhez a Ca2+ beáramlás indukálásával .
Az NMDAR-okon kívül az XYS szabályozhatja más, a megismeréssel kapcsolatos tényezők kifejeződését az agyban. A 95-ös posztszinaptikus sűrűségű fehérje (PSD-95), a szinaptofizin és az agyi eredetű neurotrofikus faktor (BDNF) elvesztését a hippokampuszban közvetlenül összefüggésbe hozták a tanulási és memóriazavarokkal . Az XYS hatását CIS patkányoknál a PSD-95 és a szinaptofizin expressziójának elősegítésével hozták összefüggésbe a hippokampuszban . Azt is kimutatták, hogy a XYS felszabályozza a BDNF-et a CIS-patkányok frontális kéregében, hippokampusz CA1 régiójában és amygdalájában . A XYS CIS kezelési folyamata során a hippokampuszban gátolták a c-Jun N-terminális kináz (JNK) jelátviteli útvonalat .
Bár nem vizsgáltuk konkrétan, hogy melyik összetevő a XYS fő hatóanyaga a tanulásra és a memóriára, eredményeink arra utalnak, hogy a XYS-ben lévő fitoösztrogének fő forrása egy további vizsgálatra érdemes jelölt. Az antidepresszánsok kutatása is adhat nekünk néhány támpontot. Jiali Liu et al. felfedezte, hogy a Bupleuri radix (Chaihu) a petróleuméter frakció szérum farmakokémiai elemzése alapján a XYS receptben lévő fő antidepressziós gyógyszer . In vitro vizsgálat kimutatta, hogy a Bupleuri radix kivonat elősegítette a neuroblasztóma sejtek proliferációját a PI3K / AKt útvonal aktiválásán keresztül . A PI3K aktiválása a mi vizsgálatunkban is megfigyelhető volt. .
A jelenlegi klinikai jelentések azt mutatják, hogy a XYS jelentős antidepresszáns terápiás hatással rendelkezik, de nincs egyértelmű toxikológiai vizsgálat a XYS toxicitásáról és mellékhatásairól részletesen. Általánosságban elmondható, hogy a XYS túl sok mellékhatás nélküli vényköteles készítménynek tekinthető. Az XYS-nek számos módosított receptje van, amelyek alapvető összetevői megegyeznek az XYS-ével. Egy nemrégiben készült metaanalízis értékelte a módosított XYS hatékonyságát és biztonságosságát a perimenopauzális szindróma kezelésében. Az összesített eredmények arra utalnak, hogy a módosított XYS hatékonyabb és biztonságosabb lehet a perimenopauzális szindróma kezelésében a hormonpótló terápiához képest . A bevont tanulmányok gyenge módszertana miatt azonban a XYS hatékonyságának és biztonságosságának megerősítéséhez szigorúbb vizsgálatokra van szükség. Xiaoxia Gao kutatócsoportja 1H nukleáris mágneses rezonancia (NMR) módszerrel arról számolt be, hogy a lipofil komponenseket tartalmazó petróleuméter frakció volt a leghatékonyabb frakció a depresszió kezelésére . Arról is beszámoltak, hogy a Bupleuri Radix, a fő antidepresszáns komponens, több toxikus hatást tudott kiváltani egészséges patkányok májában vagy veséjében, mint krónikus, kiszámíthatatlan, enyhe stresszben szenvedő patkányokban. A toxikus hatások az epesavkoncentráció növekedésével, a lizin lebomlásának elősegítésével és a szfingolipid, a glicerofoszfolipid és a zsírsavak metabolikus zavarával álltak összefüggésben . Ezt az eredményt megerősítette egy nemrégiben depressziós betegeken végzett metabolomikai vizsgálat. Az XYS antidepresszáns szerepet játszott a leucin, a valin és az izoleucin szintézisének, valamint a bináris sav, a zsírsav, az argin és a prolin metabolizmusának szabályozásával . Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy a toxikus mellékhatások megelőzése érdekében szorosan figyelemmel kell kísérni a beteg állapotát a gyógyszeradag időben történő beállításával.
5. Következtetések
Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy a nagy dózisú XYS kezelés az E2-hez hasonló hatékonysággal javította az OVX patkányok kognitív képességeit. A terápiás hatást a hippokampusz neuronjainak védelme és a hippokampusz E2 szintjének helyreállítása közvetítette. Az ERα-PI3K jelátviteli útvonal részt vett a folyamatban. Vizsgálatunk azt sugallja, hogy az XYS a perimenopauzális kognitív károsodás kezelésének egyik lehetősége lehet. Jelenleg a XYS-t elsősorban a klinikai szorongás és a depresszió kezelésében alkalmazzák. További klinikai adatokra van szükség a kognitív funkciók javítására gyakorolt hatásának ellenőrzéséhez.
Adatok elérhetősége
A tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre a megfelelő szerzőktől elérhetők.
Érdekütközések
A szerzők kijelentik, hogy semmilyen formában nem állnak összeférhetetlenségben.
A szerzők hozzájárulása
Lina Liu és Fei Ge egyenlő mértékben járultak hozzá a kutatáshoz.
Köszönet
A kutatást a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795 és 81903974); a Jiangsu tartomány Természettudományi Alapítványa (Grant no. BK20181235); a Jiangsu tartományi Hagyományos Kínai Orvosi Hivatal (Grant no. YB2017066); a Nanjing Science and Technology Development Plan Project (Grant no. 201715072); a Jiangsu Tartományi Kínai Orvosi Kórház projektje (Grant no. Y2018CX09); és a Jiangsu Felsőoktatási Intézmények Kiemelt Akadémiai Programfejlesztése által finanszírozott projekt.