Přísluším k hematologické zájmové skupině a vždy si ráda prohlížím případové studie a otázky, které zveřejňují ostatní technici. Tato skupina je nadnárodní, takže vidím příspěvky od techniků z celého světa. Je zajímavé vidět podobnosti a rozdíly ve standardních operačních postupech a rolích, které technici hrají v různých oblastech a různých zemích. Je také zajímavé vidět, že se všichni setkáváme se stejnými typy problémů a obtížných vzorků!V posledních několika měsících jsem v této hematologické zájmové skupině zaznamenal mnoho dotazů a komentářů týkajících se řešení shlukování trombocytů, a proto využívám této příležitosti, abych vnesl trochu světla do těchto složitých vzorků. Případ, který uvádím, a fotografie jsou laskavostí Abu Jad Caesara, který je vedoucím laboratoře v laboratořích Medicare – pobočka Tulkarm v Palestině.
Pacientovi byl proveden krevní obraz na přístroji Nihon Kohden 6410. Hodnota WBC byla 12,7 x 103μl, impedanční počet trombocytů byl při prvním spuštění 20 000/μl, ostatní parametry se jevily v normálních mezích. Vzorek byl zahřát a k vyloučení pseudotrombocytopenie byla vyžádána zkumavka s Na Citrátem, po zahřátí byl znovu proveden test EDTA s počtem trombocytů 0/μl. Byla provedena zkumavka s Na Citrátem a počet trombocytů z přístroje byl 189 000/μl. (Obrázek 1) Vzhledem k poměru krev:antikoagulans ve zkumavce s Na Citrátem byl použit násobek 1,1, takže počet trombocytů v Na Citrátu byl 207 900/μl. Byly zhotoveny, obarveny a vyšetřeny preparáty. Snímek 1 ukazuje shlukování ve zkumavce s EDTA. Snímek 2 ukazuje nátěr ze zkumavky s Na Citrátem bez vizuálního shlukování.
Odběr krevního obrazu byl hlášen s následujícím komentářem:Pozorováno shlukování trombocytů, odebrány 2 vzorky k vyloučení trombocytopenie. V nátěru EDTAcelé krve bylo zaznamenáno mnoho shluků trombocytů (EDTA indukovaná trombocytopenie). Závěr: Trombocyty jsou přiměřené a odhadují se na přibližně 200 000/μl.
Počty trombocytů v normálním rozmezí nám obvykle nedělají velké problémy při hlášení, i když je přítomno nějaké shlukování, hlavně proto, že jsou normální. Adekvátní počty trombocytů spadají do typického referenčního rozmezípřibližně 150- 450 x 103/μl. Pokud jsou na přístroji příznaky abnormálního rozptylu nebo shlukování trombocytů, doporučuje se opakovat vyšetření jinou metodou. Pokud je počáteční počet proveden impedančním počítáním, mnoho analyzátorů může také vykazovat optické nebo fluorescenční počty trombocytů. Při impedančním počítání mohou být jako trombocyty započítány velmi malé krvinky nebo jejich fragmenty, což vede k falešně zvýšenému počtu trombocytů. Při optickém počítání mohou být velké trombocyty počítány jako RBC, čímž se počet falešně sníží. Některé hematologické analyzátory Sysmex používajíimpedanční a optické počítání a také fluorescenční počítání trombocytů, které používá specifické barvivo pro trombocyty a poskytuje přesné počty trombocytů bezinterferencí jiných metod. Normální počet trombocytů, i když je na nátěru vidět shlukování, je obvykle stále odhadován jako normální (nebo může být příležitostně zvýšen.)
Trombocytopenie může být na druhé straně v hematologické laboratoři problémem. U trombocytopenie potřebují lékaři k diagnostice, léčbě nebo sledování pacientů přesný počet. I malé zvýšení nebo sníženímůže být při závažné trombocytopenii významné. Při menším počtu destiček se každá destička počítá!
Jednou z prvních otázek, které si musíme při zjevnétrombocytopenii položit, je, zda se jedná o skutečnou trombocytopenii, nebo zda jde o pseudotrombocytopenii(PTCP). Skutečná trombocytopenie představuje pacienta s nízkým počtem trombocytů, který může potřebovat sledování nebo lékařský zásah. Může být nebezpečné nesprávně vyhodnotit trombocytopenii, ale je také nebezpečné hlásit nízký počet trombocytů u pacienta s falešnou trombocytopenií, který ve skutečnosti trombocytopenií netrpí. Pseudotrombocytopenie neboli falešná trombocytopenie je definována jako uměle nebo chybně snížený počet trombocytů. U PTCP je nízký počet trombocytů způsoben shluky, které se počítají jako 1 trombocyt. (Tyto velké shluky mohou být také počítány jako WBC, čímž se falešně zvýší počet WBC.)
PTCP můžeme rozdělit do 2 kategorií Shlukování trombocytů je nejčastěji způsobeno preanalytickými chybami, jako jsou přeplněné nebo nedostatečně naplněné zkumavky EDTA, sražené vzorky nebo časová prodleva mezi odběrem vzorku a vyšetřením. Technici by měli zkontrolovat zkumavku na sraženiny a objem vzorku a provést kontrolu delta, aby pomohli odlišit trombocytopenii a PTCP. U zjevně „dobrého“ vzorku by však dalším krokem mělo být přezkoumání stěru. Pokud jsou na nátěru vidět sraženiny, je třeba rozhodnout, co je způsobilo. Je to první kategorie, jeden z těchto běžných preanalytických problémů, nebo je to druhá kategorie PTCP, aglutinace trombocytů in vitro? Mezi stavy, které mohou způsobit tuto aglutinaci trombocytů in vitro, patří chladové aglutininy,mnohočetný myelom, infekce, antikardiolipinové protilátky, vysoké hladiny imunoglobulinů, léčba abciximabem a pseudotrombocytopenie vyvolaná EDTA. (EDTA-PTCP) Nejčastější příčinou je EDTA indukovaná pseudotrombocytopenie. (Nakashima,2016).
Když technici mluví o problémech se shlukováním trombocytů, je to obvykle proto, že hledáme způsoby, jak vyřešit nebo přesně odhadnout počet trombocytů v těchto vzorcích, a nezdá se, že by existovala jedna jednoduchá odpověď. shlukování znemožňuje přesné počítání a i odhady mohou být velmi zrádné. Jak můžeme tyto počty odhadnout? Máme jednoduše hlásit přítomnost shlukování slovy „zdá se normální“, „snížené“ nebo „zvýšené“? Nebo bychom měli naše odhady rozdělit do více rozsahů, abychom lékařům poskytli cennější informace? a co když poskytovatel chce skutečný počet, aby mohl pacientovi poskytnout co nejlepší péči, a my nemůžeme shlukování vyřešit? Co můžeme udělat, abychom poskytli počet? Mezi první doporučené kroky patří víření vzorku po dobu 2 minut, aby se rozbily shluky trombocytů, a následná analýza. Zahřátí vzorků může také pomoci vyřešit shluky trombocytů, zejména u vzorků se studenými aglutininy nebo u vzorků, u kterých došlo ke zpoždění v testování a které byly přepravovány nebo skladovány při pokojové teplotě nebo nižší. Pokud shluky přetrvávají a opětovný odběr vzorku stále vede ke shlukování trombocytů, lze vyloučit preanalytickou chybu a podezření na pseudotrombocytopenii vyvolanou EDTA. Mnohé laboratoře nechají odebrat náhradní zkumavku nebo použijí jinou metodu, aby pomohly vyřešit shlukování.
Takže, co je EDTA indukovaná trombocytopenie(EDTA-PTCP)? Nejedná se o reprezentativní klinický obraz a není diagnostický pro žádné onemocnění nebo farmakoterapii, aleje to laboratorní jev způsobený přítomností autoprotilátek IgM/IgG závislých na EDTA. tyto protilátky se v přítomnosti EDTA vážou na membránové glykoproteiny trombocytů. Ačkoli se jedná o jev in vitro, pacienti s určitými stavy, jako jsou maligníneoplazmata, chronické onemocnění jater, infekce, těhotenství a autoimunitní onemocnění, mají zvýšené riziko EDTA-PTCP. EDTA-PTCP však byla pozorována i u pacientů, kteří jsou bez onemocnění. (Zhang, 2018)
Jaké jsou některé alternativní metody, které pomáhají řešit problémy se shlukováním trombocytů vyvolané EDTA? Pravděpodobně nejběžnější je opětovné odebrání vzorkuve zkumavce s Na-citrátem. Měly by být odebrány jak zkumavky s EDTA, tak zkumavky s Na Citrátem. V případě skutečné EDTA-PTCP, jak je vidět v naší případové studii, byste měli vidět shluky na nátěru ze zkumavky EDTA a žádné shluky na nátěru ze zkumavky Na Citrát. Vzhledem k objemu protisrážlivého činidla ve zkumavce s Na Citrátem musíte na počet trombocytů ze zkumavky s Na Citrátem použít ředicí faktor 1,1, abyste získali přesný počet trombocytů. Všimněte si však, že hematologické analyzátory jsou schváleny a validovány FDA pro použití se zkumavkami EDTA. Pokud chcete použít jiný antikoagulant, musí být metoda validována ve vaší laboratoři. Všimněte si také, že alternativní metody obvykle řeší pouze EDTA -PTCP, a nikoli shlukování způsobené jinými chladovými aglutininy, léky nebo poruchami. Trombocytopenie vyvolaná antikoagulancii se navíc neomezuje pouze na EDTA. Může se vyskytnout také u citrátua heparinu. V jedné studii bylo zjištěno, že až u 17 % pacientů s EDTA -PTCPal se tento jev projevil také u citrátu. Ve skutečnosti vědci zjistili, a my jsme to zjistili při vlastním ověřování, že některé vzorky, které se neshlukují v EDTA, se ve skutečnosti shlukují v citrátu Na. Střídavé zkumavky tedy nemusí vyřešit veškeré shlukování trombocytů. (Geok Chin Tan, 2016)
Některé laboratoře validovaly antikoagulační zkumavky ACD (kyselina citronová, citrát trisodný, dextróza) pro EDTA-PTCP. Při použití této metody musí být zkumavky EDTA a ACD spuštěny paralelně a musí být použit konverzní faktor, který odráží rozdíl v ředění vzorku v obou zkumavkách. Pro toto srovnání je třeba zvolit parametr, jako je RBC. Použitím vzorce, který vydělí RBC v EDTA RBC v ACD, získáte poměr, který odráží rozdíly v ředění mezi antikoagulanty. Tento poměr pak lze vynásobit počtem trombocytů ACD a získat tak počet trombocytů korigovaný na ACD. (CAP Today, 2014). Některé zdroje doporučují zkumavky ACD, protože výskyt shlukování s NaCitrátem může být frustrující. Existuje teorie, že kyselejší zkumavka ACD může shlukování trombocytů zabránit lépe než NaCitrát. (Manthorpe, 1981)
Méně často používané zkumavky jsou CTAD (citrát trisodný,teofylin, adenosin, dipyridamol) a heparin. CTAD působí přímo na destičky a inhibuje destičkový faktor 4, čímž minimalizuje aktivaci destiček. Nevýhodou zkumavek CTAD je, že jsou citlivé na světlo a musí být skladovány ve tmě a mohou být nákladné. Mění také poměr mezi krví a aditivním ředěním, takže je třeba použít kalkulace, jak je tomu u Na citrátu a ACD. Heparinové zkumavky jsou méně často považovány za přínosné při řešení problémů se shlukováním trombocytů, protože heparin může aktivovat trombocyty. Heparinové zkumavky jsou také dražší, a proto nejsou obecně první volbou pro EDTA-PTCP.
Slyšel jsem od techniků, že jejich laboratoře mají velmi dobrévýsledky při použití amikacinu přidaného do zkumavek EDTA, aby se zabránilo falešně nízkému počtu trombocytů u pacientů s EDTA-PTCP. Amikacin by měl být do zkumavky EDTA přidán do 1 hodiny po odběru a testování je stabilní až 4 hodiny při pokojové teplotě. Výsledky studie provedené v roce 2011 ukázaly, že přidání amikacinu do zkumavky EDTA způsobilo rychlou disociaci shluků trombocytů s malým nebo žádným vlivem na morfologii nebo ukazatele. Tato metoda se ukázala jako velmiperspektivní pro vykazování přesných počtů trombocytů u pacientů s PTCP vyvolaným multiantikoagulancii. (Zhou, 2011)
Poslední antikoagulační zkumavkou, kterou jsem viděl zmíněnou mnoha techniky v hematologické zájmové skupině, jsou zkumavky Sarstedt ThromboExact. Viděl jsem mnoho příspěvků od techniků, kteří je používají, a zdá se, že mají velmi dobrouúspěšnost. Zkumavky ThromboExact obsahují hořečnaté soli a jsou speciálně určeny ke stanovení počtu krevních destiček v případech PTCP. V současné době jsou validovány pouze pro počty trombocytů a vzorky jsou stabilní po dobu 12 hodin po odběru. je zajímavé, že před automatickými hematologickými analyzátory bylo hořčíkem antikoagulantem volby pro manuální počítání trombocytů. EDTA-PTCP byla uznána od zavedení automatického počítání trombocytů EDTA v 70. letech 20. století. Studie z roku 2013 v Německu použila zkumavky ThromboExact s vynikajícími výsledky prořešení PTCP vyvolané multiantikoagulancii. Tyto zkumavky se staly komerčně dostupnými v průběhu studie, v roce 2013. (Schuff-Werner, 2013) Bohužel pro násve Spojených státech nejsou tyto zkumavky v USA dostupné. Nedávno jsem byl na konferenci a zašel jsem za zástupci společnosti Sarstedt a zeptal se na tyto trubičky. Bylo mi řečeno, že jsou dostupné v některých částech Evropy a Asie, ale v USA nejsou schváleny FDA. Velmi nadějně jsem se zeptal, zda se snaží získat schválení FDA, a bylo mi bohužel řečeno, že „si nemyslí, že by pro ně měli trh, aby usilovali o schválení.“
Ať už se vaše laboratoř rozhodne používat jakoukoli alternativní metodu, doporučuje se odebírat EDTA a alternativní zkumavku společně. Tímto způsobem lze porovnat oba počty a přítomnost či nepřítomnost shlukování ve zkumavkách. Máme mnoho pacientů, u kterých se jednou vyskytlo shlukování, ale když poskytovatel objednápočet trombocytů Na Citrát, dostaneme nový odběr obou zkumavek EDTA a Na Citrát dohromady a u EDTA není pozorováno žádné označování nebo shlukování. V těchto případech je vhodné získat výsledky EDTA, protože není prokázána EDTA-PTCP.
Pokud má pacient nízký počet PLT bez zjištěnéhohematologického onemocnění, rodinné anamnézy a/nebo sklonu ke krvácení a byly vyloučeny předanalytické chyby, je třeba zvážit PTCP. Toneznamená, že pacient s PTCP bude mít normální počet trombocytů poodstranění shlukování. Jak bylo uvedeno výše, mnoho pacientů s EDTA-PTCP máhematologické nebo jiné poruchy a může být skutečně trombocytopenických. Vyřešení shlukování u těchto pacientů nám umožňuje poskytnout poskytovateli přesný počet trombocytů, což je u trombocytopenických pacientů velmi důležité.
Následující vývojový diagram (obrázek 4) ukazuje některé věci, které je třeba vzít v úvahu při řešení shlukování trombocytů. Naším cílem je vyřešitsrážení trombocytů tak, abychom mohli včas hlásit přesný počet trombocytů. V laboratoři, kde pracuji, jsem validoval Na citrátové zkumavky, ale zdá se, že tyto zkumavky řeší shlukování u méně než 50 % pacientů. Jako poslední možnost, jak získat přesný počet trombocytů, se v některých článcích navrhuje odebrat prstový test a provést manuální počítání. Uvedl jsem to v tabulce jako možnost pro multiantikoagulační PTCP, nicméně vzhledem k obtížnosti odběru vzorku zboží a subjektivitě počtů spolu s problémy spojenými s nezbytnými výpočty se naši patologové rozhodli, že manuální počty trombocytů nebudeme provádět. Z tohoto důvodu se v současné době zabývám sledováním srážení trombocytů a budu provádět malou interní studii, která bude paralelně porovnávatACD, CTAD a Na Citrátové zkumavky. V závislosti na těchto výsledcích pak možná budeme testovat i amikacin. Pokud dojdeme k nějakým osvíceným závěrům, napíšu další krátký blog s našimi výsledky!“
Znovu děkuji Abu Jad Caesarovi, vedoucímu laboratoře v Medicare Laboratories – pobočka Tulkarm v Palestině, který mi poskytl tento učebnicově dokonalý případ PCTP, který byl snadno vyřešen odběrem do Na Citrátu. Kéž by všichni četli učebnice a byli stejně ochotní!
- CAPToday, leden 2014. přístup online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2. vyd. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia usingan alternative anticoagulant based on magnesium salt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet clumping: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Kazuistiky v hematologii. Volume 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Falešná trombocytopenie při automatickém počítání trombocytů. Laboratorní medicína 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacin lze přidat do krve ke snížení poklesu počtu krevních destiček. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM vystudovala bakalářský obor zdravotnická technika na Merrimack College v N. Andoveru ve státě Massachusetts a magisterský obor klinické laboratorní vědy na University of Massachusetts, Lowell. Jako zdravotnický technolog pracuje již více než 30 let. Pracovala ve všech oblastech klinické laboratoře, ale zvláštní zájem má o hematologii a krevní bankovnictví. Když není zrovna zaneprázdněna rolí šílené vědkyně, najdete ji venku při jízdě na kole.
.