V této studii jsme předpokládali, že různé metody izolace RNA ovlivní výsledky při analýze genové exprese v tkáních. Metody extrakce RNA lze obecně charakterizovat buď jako extrakci fenol:chloroform s následným vysrážením alkoholem (TRIzol), fenol:chloroform s následnou extrakcí na pevné fázi (na koloně; miRVana a miRNeasy) a separaci na pevné fázi s/bez afinitní pryskyřice (Norgen total a Isolate II). Tyto metodiky byly primárně vyvinuty pro extrakci dlouhých mRNA a byly založeny na předpokladu, že všechny RNA jsou purifikovány stejně. Kromě toho existuje řada hledisek pro výběr konkrétní metody extrakce RNA, jako je kvalita, množství, cena a snadnost použití (doba do extrakce). Zde předkládáme údaje, které ukazují, že metoda použitá k extrakci RNA poskytne také variabilní výsledky ve srovnání s různými metodami v následných aplikacích, a proto je dalším důležitým hlediskem.
Tato studie ukazuje, že metody izolace RNA se liší z hlediska množství a kvality vzorků RNA a při analýze exprese miRNA a cílových genů. Vybrali jsme orgány, ze kterých může být obtížné izolovat RNA z různých důvodů. Například u izolace RNA z mozku se často uvádí nízká výtěžnost kvůli vysokému obsahu lipidů. To se projevilo zejména u soupravy Bioline Isolate II. Podle protokolu výrobce by mělo být z 10 mg potkaního/myšího mozku vyčištěno až 5 μg RNA. Příručka miRNeasy však uvádí, že ze stejného množství vstupního materiálu by mělo být možné získat 5-20 μg RNA z mozku. Řešení problémů na webových stránkách výrobce popisuje jeden z problémů s tkáněmi bohatými na lipidy, kterým je ucpávání kolony, a navrhuje snížit množství vzorku nebo zvýšit objem lyzačního pufru. Naše extrakce byly provedeny v rámci navrhovaných limitů protokolu. Následně doporučují provést předextrakci pomocí činidla TRIsure (ekvivalent TRIzolu od společnosti Bioline) a poté provést separaci na koloně pomocí soupravy k vyčištění vodné fáze. Tato metoda by pak byla srovnatelná s metodami extrakce miRVana a miRNeasy RNA a mohla by vést k lepším výtěžkům pro tuto tkáň. Kvalita RNA navíc koreluje se specifickými reakcemi tkáně na fyziologický stres před i po odumření tkáně. Tkáně, jako jsou plíce a játra, mají charakteristicky nízký RIN a malý 28S pík, protože tyto tkáně jsou náchylné k rychlejší degradaci RNA vysokými hladinami nukleáz. Pro inaktivaci nukleáz se tkáň rychle zmrazí a zabrání se jejímu rozmrazení, dokud se zvážený materiál nepřidá do extrakčního pufru. Přestože bylo zabráněno rozmrazení tkáně, nemůžeme vyloučit, že doba od eutanazie zvířete a vyříznutí orgánů do rychlého zmrazení přispěla k celkově nízkým hodnotám RIN a některým degradačním produktům pozorovaným u všech vzorků plic bez ohledu na použitou izolační soupravu. Alternativní metodou inaktivace nukleáz je použití roztoku stabilizujícího RNA, jako je RNAlater (ThermoFisher Scientific), který umožňuje pozdější zpracování nezmrazených vzorků tkání. Může pomoci zajistit integritu RNA, ale není kompatibilní se všemi postupy izolace RNA a uživatelé by si měli před provedením extrakce ověřit konkrétní metodu. Přidání píku po 60 s u některých vzorků v analýze Bioanalyzátoru naznačuje kontaminaci gDNA. U některých souprav lze na kolonách provést dodatečné ošetření DNázou, nicméně se důrazně doporučuje provést krok eliminace gDNA během kroku reverzní transkripce. Zahrnutí tohoto kroku do našich metod může vysvětlovat, proč nedošlo k interferenci při analýze exprese mRNA vzorků Norgenových plic, ale ovlivnilo to analýzu exprese miRNA, protože protokol Taqmanova testu miRNA nezahrnuje odstranění gDNA. Kromě toho je kritickým faktorem čistota vzorků RNA, protože i když by vzorky s RIN > 7 měly ve většině následných aplikací fungovat dobře, ty, které zahrnují enzymatické reakce, jako je qPCR, mohou být inhibovány nukleázami, ionty kovů nebo organickými kontaminanty. Vzorky RNA Bioline Isolate II měly obecně nižší poměry 260/230 a na jejich špatné výkonnosti se mohly podílet kontaminanty. Nakonec byly pozorovány rozdíly v obohacení o miRNA v přípravku celkové RNA. Jelikož miRNA představují malou část celkového repertoáru RNA, může být obtížné určit jejich příspěvek z analýzy integrity. Test mikroRNA Qubit nabízí vysoce selektivní detekci malých množství malých RNA i v přítomnosti běžných kontaminantů. Vysoké procento miRNA bylo běžně detekováno metodami extrakce miRVana a Norgen, avšak vzhledem k analýze integrity u preparátů celkové RNA Norgen je možné, že obohacení miRNA může být nadhodnocené, protože jsou detekovány menší fragmenty RNA po degradaci nebo oxidaci větších RNA (mRNA, rRNA nebo tRNA) nebo v případě plicních vzorků kontaminace DNA narušující výsledky Qubit. Proto jsou množství, kvalita a čistota vzorků RNA velmi důležitými faktory pro výběr konkrétní metody extrakce RNA a další výzkum, jak tyto metody optimalizovat pro vaši zájmovou tkáň, může pomoci tyto faktory zlepšit.
Profilování miRNA může poskytnout poznatky jako biomarkery pro diagnostické nebo prognostické aplikace. Panely miRNA lze například použít ke klasifikaci různých fenotypů rakoviny, k předpovědi recidivy nebo odpovědi na léčbu . Pro objevení a klinické použití biomarkerů založených na miRNA je však třeba optimalizovat a standardizovat postupy, jak RNA extrahovat, aby se předešlo rozporným výsledkům. Například metaanalýza 63 publikovaných studií, kterou provedli Zhou et al. (2014), zjistila nekonzistentní, a dokonce protichůdné výsledky při hodnocení prognostické hodnoty onkomiR, miR-21 . Autoři přičítají heterogenitu rozdílům ve zdroji vzorků, metodách detekce a normalizačních metodách, ale nezmiňují se o metodách extrakce RNA, které, jak ukazujeme, také přispívají.
Biologické funkce a cíle jen velmi málo miRNA byly experimentálně ověřeny, což je však pro využití potenciálu terapie založené na miRNA zásadní. Odhalení biologických funkcí specifických pro jednotlivé tkáně navíc pomůže určit jejich terapeutické působení a potenciální necílové účinky v normálních tkáních. Ověřování interakcí miRNA-mRNA se provádí především v testech na buněčných kulturách, které zahrnují umělou manipulaci s endogenními miRNA. Hladiny dosažené manipulací s buněčnými kulturami (např. transfekcí mimikry) však obvykle nedosahují fyziologických hladin pozorovaných in vivo, proto je důležité rekapitulovat výsledky na vhodných zvířecích modelech. V současné době neexistují žádné zprávy, které by přímo porovnávaly detekci miRNA a cílových genů ze vzorků celkové RNA pomocí různých extrakčních metod. Ukázali jsme, že metody extrakce RNA se liší svou účinností při izolaci jak krátké, tak dlouhé RNA, a proto je třeba pečlivě zvážit výběr vhodné metody, pokud chcete detekovat obě z téhož vzorku.
Předchozí výzkumy běžně předpokládaly, že všechny druhy RNA jsou purifikovány stejně. Objevilo se však několik zpráv naznačujících rozdíly v účinnosti extrakce v závislosti na metodě použité pro izolaci RNA. Kim et al. (2011) stáhli svůj článek v Molecular Cell, protože zjistili, že jejich závěry o rozdílech v expresi miRNA z buněk pěstovaných při různé konfluenci (vysoká hustota versus nízká hustota) a při jejich oddělování od kultivační misky (adherentní versus suspenze) byly ve skutečnosti vysvětleny rozdíly v účinnosti extrakce RNA metodou TRIzol . Zjistili, že miRNA s nízkým obsahem GC a stabilní sekundární strukturou se během extrakce ztrácejí, místo aby byly degradovány v buňkách, jak původně publikovali . Předchozí výsledky El-Khouryho et al. (2016) zjistily rozdíly ve výtěžnosti miRNA z buněk, plazmy a exozomů získaných z moči/plazmy při porovnání extrakčních souprav TRIzol LS, miRNeasy sérum/plazma a miRCURY biofluid . Autoři zjistili, že souprava miRCURY izolovala vysoce čistou RNA, ale špatně získávala miRNA, souprava TRIzol poskytovala RNA nízké čistoty, což mělo vliv na účinnost PCR, zatímco souprava miRNeasy poskytovala RNA nízké kvality, ale pro detekci miRNA se osvědčila nejlépe. Podobně McAlexander et al. (2013) zjistili rozdíly v extrakci miRNA z plazmy a mozkomíšního moku . Porovnávali extrakce miRVana, miRCURY Cell and Plant kit a TRIzol LS s glykogenem jako nosičem a bez něj. miRVana byla podobná s glykogenem i bez něj, zatímco miRCURY bez glykogenu měla o něco nižší výtěžnost miRNA než miRVana. Glykogen však výrazně zlepšil výtěžnost miRNA u soupravy miRCURY, ale zhoršil nízkou výtěžnost a variabilitu u extrakce TRIzol. Dále porovnávali soupravu miRCURY Cell and Plant s metodami extrakce miRCURY Biofluids a miRNeasy sérum/plazma s glykogenem jako nosičem a zjistili, že souprava miRCURY Biofluids měla nejvyšší relativní množství nasypaných exogenních miRNA, a dospěli k závěru, že tato metoda je pro jejich konkrétní aplikaci lepší. Souhrnně tyto studie zdůrazňují rozdíly ve výtěžnosti RNA při použití různých extrakčních metod a naznačují potřebu optimalizace pro vaši buňku, tkáň a/nebo tekutinu, která vás zajímá.
Během pracovního postupu existuje několik kroků, které mohou vnést experimentální odchylky. Počínaje metodou fixace nebo zmrazení tkáně, skladováním materiálu, metodou extrakce RNA, metodou použitou pro reverzní transkripci a amplifikaci qPCR nebo jiné následné platformy. V této studii jsme se pokusili kontrolovat některé z těchto proměnných bleskovým zmrazením tkání, skladováním při – 80 °C, zabráněním rozmrazování před extrakcí a použitím většiny doporučených postupů pro analýzu exprese miRNA. Například se ukázalo, že použití sekvenčně specifických RT primerů na rozdíl od univerzálního RT primeru je lepší pro specifickou amplifikaci produktu . qPCR je považována za zlatý standard pro analýzu exprese miRNA a cílů díky své citlivosti a specifičnosti oproti globálním profilovacím platformám. Důležité je, že kvalita získaných výsledků je důležitější než samotný počet miRNA profilovaných z velkých platforem založených na sekvenování. Navíc, ačkoli jsme neporovnávali vliv obohacení miRNA z našich vzorků RNA, předchozí zprávy jej nedoporučují, zejména u globálních profilovacích platforem miRNA. Například Redshaw et al. (2013) zjistili, že postup obohacování krátké RNA má za následek výrazně nižší relativní hladiny miRNA při porovnání celkové RNA a obohaceného materiálu, konkrétně postup obohacování snížil počet kopií miRNA až o 25 % počtu přítomného z předem obohacených vzorků a že tato ztráta se liší pro různé sekvence miRNA. Proto údaje o miRNA z celkových a krátkých preparátů RNA nemusí být přímo srovnatelné. Kromě toho se předpokládá, že větší RNA může fungovat jako nosič malých RNA . Zda by metody obohacené o miRNA pro všechny společnosti vedly k lepšímu výtěžku z tkání, je třeba ještě určit. Přestože společnost Bioline navrhuje samostatnou soupravu pro izolaci miRNA, použili jsme soupravu Isolate II total RNA pro přímé srovnání s ostatními extrakčními metodami, protože souprava specifická pro miRNA neumožňuje izolaci krátké i dlouhé RNA ze stejné eluce. Spíše se nejprve obohatí a izolují druhy miRNA a poté lze extrahovat dlouhé RNA, čímž vzniknou dvě oddělené frakce. Přestože souprava Isolate II není optimalizována pro izolaci malých RNA jako soupravy miRVana nebo miRNeasy, nebyla také lepší pro expresi cílových genů. Vzhledem k velkému rozdílu mezi některými soupravami by se výzkumníci měli rozhodnout pro robustnější metodu extrakce.