Los trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs) son los componentes esenciales de las moléculas de ácido nucleico y, como tales, son componentes necesarios de las mezclas de PCR, ya que sin ellos no se podría generar nuevo ADN (amplificado). Los cuatro desoxinucleótidos individuales que componen una secuencia de ADN (es decir trifosfato de desoxiadenosina, dATP; trifosfato de desoximidina, dTTP; trifosfato de desocitosina, dCTP y deoxiguanosina trifosfato, dGTP) suelen añadirse a las mezclas de PCR y RT-PCR en cantidades equimolares, aunque si la secuencia de ADN diana que se va a amplificar por PCR está compuesta principalmente por dATP/dTTP (proporción AT) o principalmente por dGTP/dCTP (proporción GC), la proporción molar de dNTPs añadida a la mezcla de PCR puede modificarse para tener en cuenta este desequilibrio. Los dNTPs suelen comprarse individualmente o en forma de mezcla (equimolar) a proveedores comerciales (por ejemplo, Roche, Promega, etc.), y son químicamente estables cuando se almacenan en soluciones acuosas ligeramente alcalinas a -20°C. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los dNTPs son naturalmente ácidos en solución, por lo que las soluciones de trabajo y de reserva pueden tener que ser neutralizadas con compuestos alcalinos antes de su almacenamiento a largo plazo. Las soluciones de dNTP neutralizadas se ajustan normalmente a soluciones madre de 10 mM mediante espectrofotometría, o añadiendo el volumen correcto de agua estéril al producto liofilizado directamente después de su síntesis química. Algunas PCR pueden beneficiarse del uso de dNTPs «de grado PCR» altamente purificados (Roche) que contienen menos del 0,9% de deoxinucleótidos difosfatos (dNDP), tienen una pureza de >99% y están libres de contaminantes como los nucleótidos modificados y el tetrapirofosfato. Estos dNTPs (más caros) de alta pureza pueden ser útiles para amplificar con éxito el ADN de la PCR a partir de preparaciones que contienen un número muy bajo de copias del ADN objetivo.
En algunas aplicaciones y protocolos de PCR, uno de los cuatro dNTPs puede sustituirse por un dNTP análogo, por ejemplo, inosina, 7-deaza-2′ -desoxiguanosina, o un dNTP modificado, por ejemplo, un dNTP marcado con biotina, fluoróforo o radioactivamente. Dichas modificaciones permiten realizar otras aplicaciones de procesamiento posterior a la PCR.