Sinergia funcional positiva de dímeros de proteínas artificiales estructuralmente integrados y ensamblados mediante química de clic

Sitios de interfaz de química de clic

Suponemos que las áreas de la superficie de una proteína que son compatibles en términos de asociación tienen más probabilidades de generar una estructura integrada a través de la formación de interacciones no covalentes mutuamente compatibles. Como las proteínas son monoméricas, estas interacciones son, en el mejor de los casos, débiles y transitorias, por lo que no persistirán. El primer paso es identificar las regiones de las proteínas objetivo que tienen el potencial inherente de interactuar. Se utilizó ClusPro 2.040 (cluspro.org) para generar posibles configuraciones de dímeros. Los modelos de homodímeros de sfGFP resultantes se refinaron, analizaron y clasificaron utilizando RosettaDock41,42 (Tabla suplementaria 1). La configuración mejor clasificada se muestra en la Fig. 1b (que es el modelo más cercano a la estructura determinada a continuación; vide infra), y las siguientes 4 configuraciones clasificadas se muestran en la Fig. 1 suplementaria. Aunque se observaron diferentes orientaciones de una sfGFP con respecto a la otra, el acoplamiento reveló que los residuos 145-148, 202-207 y 221-224 contribuyen de forma rutinaria a la interfaz del dímero. Para unir las dos proteínas, se utilizó la química Click bioortogonal codificada genéticamente (Fig. 1a). La ventaja comparada con, por ejemplo, los enlaces disulfuro, incluye cadenas laterales más largas para superar posibles choques estéricos, una estabilidad mejorada de los enlaces cruzados y la capacidad de generar no simétricos (diferentes residuos de enlace en diferentes monómeros) y heterodímeros de una manera diseñada 1 a 1 (vide infra).

Basado en los modelos de dímero, se seleccionaron tres residuos para sustituirlos por los dos ncAAs compatibles con Click, SCO43 (alquino tenso) y azF (azida)44,45 (Fig. 1a). Se eligieron H148 y Q204 por su ubicación en la supuesta interfaz del dímero (Fig. 1b y Fig. 1 suplementaria). Se sabe que ambos residuos se modifican fácilmente con aductos de cicloocina de moléculas pequeñas en la incorporación de azF34,46, y se encuentran cerca del centro funcional, el cromóforo de sfGFP (CRO) (Fig. 1b). El análisis de desplazamiento de movilidad en gel reveló que la dimerización fue exitosa (Fig. 1c, d); esto fue confirmado por el análisis de espectrometría de masas (Fig. 2 suplementaria). No se predijo que el residuo 132 estuviera en la interfaz del dímero (Fig. 1b y Suplemento 1), pero se sabe que es compatible con una serie de aductos alquílicos tensos que van desde los tintes46 hasta los nanotubos de carbono35 y el ADN monocatenario36. Por lo tanto, actúa como una buena prueba de nuestra capacidad para predecir las interfaces proteína-proteína y la compatibilidad de la reacción Click. A pesar de que el residuo 132 está expuesto en la superficie, no se observó ningún producto dímero utilizando sfGFP132azF con la proteína que contiene SCO (Fig. 3 suplementaria), lo que indica la importancia de la compatibilidad de la interfaz de superficie y la utilidad del análisis in silico para ayudar a identificar los sitios compatibles con la química click. Los choques estéricos y/o las interacciones proteína-proteína que persisten durante más tiempo en otras regiones pueden dificultar el entrecruzamiento covalente en el residuo 132.

El cambio funcional positivo al formar el dímero sfGFP148x2

H148 forma un enlace H con CRO (Fig. 1b) y desempeña un papel importante en el traslado de protones que regula la población de la forma neutra A (λmax ~ 400 nm, CRO A) y la forma aniónica B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 presente en el estado básico. La forma B predomina en la sfGFP, pero al incorporar azF en lugar de H148 (sfGFP148azF) la eliminación del enlace H hace que ahora predomine el estado A33,34 (Fig. 2a y Tabla 1). La incorporación de SCO en el residuo 148 (sfGFP148SCO) provoca un efecto similar, con el predominio de CRO A pero con un menor desplazamiento hacia el rojo (λmax 492 nm) en la forma menor de CRO B (Fig. 2a y Tabla 1).

La dimerización de sfGFP148azF y sfGFP148SCO produce dos efectos positivos significativos: (i) enciende la fluorescencia a ~490 nm debido a la promoción de la forma CRO B; (ii) mejora enormemente el brillo gracias al aumento del coeficiente de absorbancia molar a 490 nm (Fig. 2a y Tabla 1). El principal pico de excitación se desplaza hacia el rojo en la dimerización (λmax 492 nm) en comparación con sfGFPWT (λmax 485 nm) (Tabla Suplementaria 3). La relación de absorbencia de 490:400 nm se desplaza en un orden de magnitud de ~0,5 para los monómeros a ~5 para el dímero, con la forma CRO B dominando el espectro de absorbencia del dímero (Fig. 2a) a pesar de la aparente ausencia de una especie que pueda sustituir el papel del grupo imidazol H148. Los ejemplos anteriores de modificación de la sfGFP148azF con aductos de moléculas pequeñas o con fotoactivación dan como resultado, en el mejor de los casos, una conversión parcial a la forma CRO B33,34. El cambio de 10 veces en la absorbancia se refleja en la emisión de fluorescencia; la excitación a 490 nm resulta en una emisión ~20 veces mayor que la de cualquiera de los monómeros (Fig. 2a). Además, el dímero muestra una función mejorada incluso cuando se compara con la supercarga original sfGFPWT (Fig. 2b y Tabla 1). La absorbancia molar y el brillo aumentaron en un ~320% para sfGFP148x2 (~160% en una base por CRO) (Fig. 2b) más de lo esperado para un simple aumento aditivo si las unidades monoméricas están actuando independientemente una de la otra.

Para investigar la importancia del enlace biortogonal construimos un enlace clásico basado en disulfuro mutando H148 a cisteína. Las variantes sfGFPH148C se dimerizaron pero sólo en presencia de Cu2+ (Fig. Suplementaria 4). Las propiedades espectrales sugerían que el dímero era menos fluorescente en comparación con sfGFP148x2 y sfGFPWT (Fig. 4 suplementaria). El monómero sfGFPH148C mostraba el cambio esperado de CRO B a CRO A. Aunque se observó un cambio de CRO A a CRO B en la dimerización de sfGFPH148C, el dímero tenía una absorbancia molar por CRO menor que sfGFPWT y significativamente menor que sfGFP148x2; todavía se observaba una población significativa del estado A. La emisión de fluorescencia en la excitación a 490 nm para el sfGFPH148C dimérico era aproximadamente la mitad de la de sfGFPWT. Por lo tanto, el enfoque biortogonal generó una especie dimérica de mejor rendimiento que la unión clásica de enlaces disulfuro.

Base molecular para la conmutación funcional en sfGFP148x2

La estructura cristalina de sfGFP148x2 (véase la Tabla Suplementaria 2 para las estadísticas) revela que los monómeros forman una extensa interfaz de dímero con interacciones de largo alcance que unen los dos centros CRO. Las unidades monoméricas de la sfGFP148x2 se organizan en una disposición cuasi-simétrica cabeza-cola desplazada en ~45° una respecto de la otra (Fig. 3a). La disposición antiparalela de los monómeros de lado a lado es la más parecida a la del modelo de mayor rango (Fig. 1 y Tabla 1 suplementarias). La densidad de electrones del nuevo enlace cruzado triazol está claramente definida (Fig. 3b) y forma el enlace alargado anti-1,4-triazol que está parcialmente enterrado e íntimamente asociado con ambas unidades monoméricas, formando así una parte integral de la interfaz del dímero (Fig. 3c). Los CROs están separados 15 Å apuntando uno hacia el otro (Fig. 3a).

La interfaz tiene características similares a los dímeros naturales48. El área enterrada de la interfaz es de ~1300 Å2, y generalmente contribuyen los mismos residuos de cada monómero (Fig. 3c, d). Los enlaces H juegan un papel importante con los residuos E142, N146, S147, N149 y N170 de ambos monómeros que contribuyen a ocho enlaces H entre subunidades (Fig. 3b). La estructura muestra que las interfaces naturales de los dímeros pueden ser imitadas y estabilizadas mediante el uso de monómeros con enlaces Click, que el modelado original sugería que eran factibles pero que probablemente eran demasiado débiles o transitorios para persistir sin el enlace incrustado. Por lo tanto, es posible que nuestro enfoque pueda utilizarse para estabilizar interacciones proteína-proteína débiles más ampliamente transitorias, formando así interfaces definidas.

La dimerización induce una serie de cambios conformacionales para formar una red de interacción de largo alcance que subyace al mecanismo por el cual la sfGFP se enciende y aumenta su brillo. La estructura de sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 muestra que 148azF ocupa una posición similar a la de H148 en sfGFPWT pero no puede del enlace H crítico al grupo OH del fenol de CRO que promueve la formación del estado B de CRO. En la dimerización, la modificación de 148azF a través de la formación del enlace triazol con 148SCO en el monómero cognado da como resultado un cambio tanto en su columna vertebral como en la posición de la cadena lateral causando un agujero que ahora puede ser ocupado por una molécula de agua en el dímero (W1azF en la Fig. 4a). El agua puede unirse por H a CROazF y al carbonilo del esqueleto de 148azF (Fig. 4). Un agua equivalente está presente en la unidad monomérica sfGFP148SCO, (W1SCO) que forma interacciones similares. Estas moléculas de agua estructuradas tienen el potencial de reemplazar la interacción del enlace H que se pierde al eliminar el H148, activando así el dímero mediante la promoción de la formación del CRO B en el estado básico. Las moléculas de agua también están enterradas en la interfaz del dímero, por lo que el intercambio dinámico con el disolvente se reducirá considerablemente. Además, las dos CROs están ahora unidas por una red extendida predominantemente de agua que abarca la interfaz del dímero (Fig. 4b, c). El análisis de la composición del túnel reveló que tres moléculas de agua en cada unidad (W1azF/SCO, W2azF/SCO y W3azF/SCO) son simétricas; W4 combinada con la columna vertebral de F145SCO proporcionan el puente a través de la interfaz del dímero para unir las dos redes de agua. Así, la dimerización genera una red de enlaces H extendida y rica en agua entre los monómeros, promoviendo así un cambio del estado A CRO a la forma B.

Análisis de fluorescencia de una sola molécula de sfGFP148x2

Se utilizó la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para investigar el comportamiento fluorescente de los dímeros de sfGFP148x2 a nivel de una sola molécula. El curso temporal de la intensidad de la fluorescencia de los dímeros individuales de sfGFP148x2 demostró una gama de estados de intensidad, predominando la fluorescencia a ~80-100 cuentas y mostrando una mayor longevidad que la subpoblación de estados de mayor intensidad, caracterizados por breves incursiones a una gama de intensidades de ~100 a 300 cuentas (Fig. 2c). Las trazas de fluorescencia también demuestran una prolongada fotoestabilidad con largos periodos hasta el fotoblanqueo (Fig. 2c y Fig. Suplementaria 5). En comparación, sfGFPWT se fotoblanquea más rápidamente, con trazos de fluorescencia que muestran un único estado de intensidad en el que los estados de encendido generalmente duran períodos más cortos (Fig. 6 suplementaria). Además, se encontró que la sfGFPWT monomérica existe a veces en un estado inicial oscuro, no fluorescente, antes de la iniciación de la fluorescencia y el posterior fotoblanqueo (Fig. Suplementaria 6). La extracción del promedio de tiempo consecutivo de fluorescencia antes del fotoblanqueo y de la ocupación de los estados no fluorescentes transitorios (parpadeo) revela que sfGFP148x2 muestra períodos más largos de fluorescencia continua (media de 0,9 s), en comparación con sfGFPWT (0,65 s). Dada la similitud en la intensidad de fluorescencia medida de una sola molécula, el aumento de los tiempos de ON y el tiempo de vida de fotoblanqueo probablemente contribuyen al aumento de fluorescencia observado en las mediciones de conjuntos de estado estable de sfGFP148x2 (Fig. 2a).

En un intento de racionalizar la gama de estados de fluorescencia observados en las trazas de dímero, se generó un histograma de todas las intensidades medidas (Fig. 2c). A diferencia de la sfGFPWT (Fig. 6 suplementaria) que muestra una única distribución log-normal49, la sfGFP148x2 favoreció un ajuste de dos componentes50 (Fig. 2c). La distribución de intensidad medida muestra un pico predominante de menor intensidad (~90 cuentas) y un pico de mayor intensidad parcialmente superpuesto, como consecuencia de las breves incursiones a estados de mayor intensidad observadas en las trazas de fluorescencia de una sola molécula. Aunque normalmente se esperaría una distribución bimodal de la intensidad en un dímero compuesto por dos fluoróforos activos de forma independiente, en el que cada fluoróforo se fotoblanquea de forma secuencial, los trazos de intensidad de una sola molécula no son consistentes con este modelo y muestran una falta de dos estados bien definidos. El comportamiento simple del estado de encendido/apagado de la sfGFPWT se observa con poca frecuencia en las trazas de los dímeros, que no se presentan como el aducto previsto de dos trazas monoméricas, sino que muestran un comportamiento más complejo.

Función mejorada al formar el dímero sfGFP204x2

Para explorar cómo los diferentes sitios de unión pueden provocar efectos funcionales, investigamos el dímero alternativo sfGFP204x2 (Fig. 5a) construido anteriormente (Fig. 1d). Encontramos que la dimerización mejoraba las propiedades espectrales por encima de la simple adición de las proteínas monoméricas o sfGFPWT destacando de nuevo los beneficios sinérgicos de la dimerización. La incorporación de azF o SCO en el residuo 204 tuvo poco efecto sobre las propiedades espectrales en comparación con la sfGFPWT 46 (Fig. 5b y Tabla 1). La forma B CRO predominó en las formas monoméricas; tanto la absorbancia molar como las intensidades de emisión fueron similares entre sí y con sfGFPWT. La emisión de fluorescencia de la sfGFP204SCO estaba ligeramente reducida (80% de la sfGFPWT; Tabla 1). Al formar el dímero sfGFP204x2 (véase la Fig. 1d y la Fig. 2 suplementaria para las pruebas) el análisis espectral mostró una mejora funcional en términos de los parámetros espectrales centrales: coeficiente de absorbencia molar (ε) y emisión de fluorescencia (Fig. 5b y Tabla 1). En la dimerización, ε aumentó hasta un 400% en comparación con los monómeros de partida, llegando a 160.000 M-1 cm-1. Esto equivale a una absorbencia molar media por CRO de 80.000 M-1 cm-1, casi duplicando la luminosidad en comparación con los monómeros de partida, y 31.000 M-1 cm-1 mayor en comparación con sfGFPWT. En consonancia con el aumento de la capacidad de absorción de luz, la emisión de fluorescencia también aumentó; la emisión normalizada por CRO fue un 180% mayor que la del monómero sfGFP204azF. Utilizando el cálculo de Strickler-Berg51 (sitio web huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) los tiempos de vida de la fluorescencia caen de 3,2 ns para la sfGFPWT a 0,92 ns para la sfGFP204x2. Así, al igual que con la sfGFP148x2, la estructura dimérica de la sfGFP204x2 tiene una mayor probabilidad de excitación electrónica y de emisión de fluorescencia en comparación con las formas monoméricas (véase la Fig. 8 suplementaria para la comparación espectral de los dímeros). Esto es aún más impresionante para ambas formas diméricas ya que sfGFPWT es un punto de referencia para el rendimiento de la proteína verde fluorescente.

La importancia de la simetría para la sinergia

Los homodímeros proteicos naturales suelen ser simétricos1,52 y dicha simetría se imitó en nuestro dímero artificial a través de un residuo de enlace cruzado común. Investigamos la importancia de un residuo de reticulación común (como imitación de la simetría estructural) para la sinergia funcional. La ventaja de la química biortogonal es que las asas de reacción mutuamente compatibles permiten la construcción de pares definidos (es decir, 148 + 204 = 148-204 y no 148-148 o 204-204) evitando así la formación de productos indeseables que serán difíciles de separar.

Se generaron dímeros que enlazaban los residuos 148 y 204 en las dos combinaciones disponibles (148SCO+204azF y 148azF+204SOC). La fluorescencia en estado estacionario reveló que en ambas formas diméricas, las formas protonadas y desprotonadas de CRO estaban claramente presentes (Fig. 6a, b). El dímero enlazado 148azF-204SCO mostró un cambio en las poblaciones relativas de las formas A y B, con un aumento significativo del coeficiente de absorbencia molar a 490 nm (Fig. 6a); era casi el doble del original sfGFP204SCO y ~30% más alto que el predicho por simple adición de los espectros de los monómeros. La altura relativa del pico de 400 nm sigue siendo similar tanto en la sfGFP148azF como en el dímero enlazado 148azF-204SCO, lo que sugiere que la población de la forma desprotonada es similar en el dímero que en el monómero original. La dimerización a través de la combinación 148SCO-204azF cambió las poblaciones relativas de las formas protonadas y desprotonadas, pero la reducción en el pico de absorbencia de 400 nm no fue igualada por un aumento concomitante en el pico de 490 nm (Fig. 6b). De hecho, la dimerización fue en gran medida perjudicial, ya que ambos picos de absorbancia principales tenían un coeficiente de absorbancia molar inferior al de los espectros de adición simple de los monómeros (Fig. 6b). Está claro que los dímeros unidos asimétricamente son menos fluorescentes y contienen una población mixta significativa de los dos estados CRO en comparación con los dímeros unidos simétricamente, por lo que en este caso, la simetría tiene importantes implicaciones funcionales.

Los heterodímeros y la integración funcional

Los heterodímeros, en los que un dímero se compone de dos proteínas diferentes, es un estado de dimerización alternativo comúnmente observado1,2. También permite diseñar nuevos complejos en los que se pueden unir proteínas funcionalmente distintas. La ventaja del acoplamiento bioortogonal es la capacidad de generar (hetero)dímeros definidos, de una sola especie, compuestos por dos unidades proteicas diferentes (es decir, A + B = A-B, no una mezcla de A-A, B-B, A-B, que puede ser difícil de separar). Se eligió la proteína fluorescente amarilla Venus29 como proteína asociada a la sfGFP, dado el solapamiento espectral entre ambas (Fig. 9 suplementaria). Las diferencias de secuencia se muestran en la Fig. Suplementaria 10.

SfGFP148SCO se combinó con el equivalente azF que contiene Venus (Venus148azF) para generar GFVen148 (véase la Fig. Suplementaria 11 para las pruebas). Surgen nuevas características espectrales que sugieren que se ha generado un sistema integrado. La formación de GFVen148 genera un dímero que muestra un brillo mejorado en comparación con sfGFP148SCO o Venus148azF (Fig. 7a y Tabla Suplementaria 3). Curiosamente, el dímero tiene propiedades espectrales intermedias de los monómeros individuales sin ningún ensanchamiento significativo de los picos (Fig. 7a, b y Fig. Suplementaria 12a) lo que sugiere que los dos centros CRO se han integrado funcionalmente en términos de emisión de fluorescencia. El mayor λmax es 505 nm, intermedio entre sfGFP (492 nm) y Venus (517 nm). La ε equivalente a la forma B CRO (región de 490-510 nm) aumenta significativamente (~4-5 veces), superior a los espectros aditivos simples de los monómeros, mientras que la población A CRO disminuye pero se sigue observando (Fig. 7a). Esto se corresponde con un aumento de ~4 veces en la intensidad de la emisión en la excitación a 505 nm (Fig. 7b). Se observa un único pico de emisión que también es intermedio entre los dos monómeros, independientemente de la longitud de onda de excitación (λEM a 517 nm; Fig. 7b, c); se observó un único pico, en lugar de uno doble o ensanchado, en la excitación a 490 nm (capaz de excitar ambos CROs), lo que sugiere que una única especie está emitiendo. Un espectro aditivo de espectros de monómeros individuales que simula dos proteínas que actúan de forma independiente apoya la idea de una nueva función integrada, ya que es más amplio y está desplazado al rojo en comparación con el perfil de emisión de GFVen148x2 medido (Fig. suplementaria 12b). También se midió la emisión en la excitación a 400 nm ya que Venus148azF tiene poca absorbancia a esta longitud de onda en comparación con GFVen148. La intensidad de la emisión fue 30 veces mayor para el GFVen148 en comparación con el Venus148azF monomérico, con un pico de emisión a 517 nm (Fig. 7c y Fig. 12c suplementaria). En lugar de mostrar un FRET clásico, como cabría esperar (vide supra), GFVen148 parece actuar como una entidad única en términos de emisión de fluorescencia. Esto podría sugerir que dos CROs están actuando ahora predominantemente como una especie con los aspectos estructurales observados para sfGFP148x2 (como la red de agua) jugando un papel. La presencia de un estado A neutro significativo del CRO sugiere que las dos unidades monoméricas no están totalmente sincronizadas. Sin embargo, esto no niega el claro impacto que la dimerización puede tener en la generación de nuevas propiedades espectrales como las que se observan en GFVen148.

Al igual que con sfGFP, la incorporación de azF en lugar de Q204 (denominada Venus204azF) tuvo poco efecto sobre las propiedades espectrales de Venus (Tabla Suplementaria 3). La unión covalente a través de 204 SPAAC (haciendo GFVen204) generó con éxito un dímero (Fig. 11 suplementaria). GFVen204 combinó las características espectrales de ambos monómeros generando una especie con λMax tanto a 490 como a 514 nm (relación de 1:1,2) (Fig. 7e, f y Tabla Suplementaria 3). Venus204 también absorbe a 490 nm pero en una proporción de 1:2,7 con respecto a 514 nm. La formación de dímeros volvió a aumentar la absorbencia molar por encima de la de los monómeros individuales; en particular, ε aumentó en ~26.000 M-1 cm-1 (~27%) para la λmax asociada a Venus (514 nm), donde hay poca contribución para sfGFP. Para investigar la comunicación entre los monómeros, se monitorizó la emisión de fluorescencia en la excitación a cuatro longitudes de onda distintas: 400 nm (sólo sfGFP); 450 nm (sfGFP, Venus menor); 490 nm (sfGFP λmax, hombro de Venus); 510 (Venus, sfGFP menor). En todas las longitudes de onda de excitación, el único pico de emisión claro estaba a 528 nm (Fig. 7b), correspondiente a Venus, que indicaba la comunicación por transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). No se observó un pico de emisión correlativo a sfGFP204SCO (~510 nm) ni siquiera en la excitación a las longitudes de onda más bajas específicas para sfGFP. Tampoco se observó el pico de emisión intermedio característico de GFVen148, lo que pone de manifiesto las nuevas características del heterodímero 148. La diferencia más significativa se observó en la excitación a 400 nm, donde hay un aumento de 14 veces en la intensidad de emisión a 528 nm para el GFVen204 en comparación con Venus204azF (Fig. 7f, recuadro). La eficiencia FRET relativa calculada tras la descomposición espectral fue de aproximadamente el 90%. Por lo tanto, los dos centros funcionales se comunican a través de la transferencia de energía (Fig. 7g) de una manera altamente eficiente.