Problemas inicialesEditar
TermolabilidadEditar
La aplicación inicial de la recombinasa FLP-FRT no funcionó en mamíferos. La proteína FLP era termolábil (se desnaturalizaba a temperaturas elevadas) y, por tanto, no era útil en el modelo de mamíferos debido a las elevadas temperaturas corporales de estos sistemas modelo. Sin embargo, debido a las patentes y a las restricciones en el uso de la recombinación Cre-Lox, se puso gran interés en producir un casete FLP-FRT más termoestable. Algunos de los primeros resultados fueron producidos por Buchholz et al. (1997) utilizando la mutagénesis cíclica en Escherichia coli . En su investigación, los autores transfectaron células de E. coli con dos plásmidos: uno que codificaba proteínas FLP mutadas aleatoriamente, corriente abajo de un promotor de arabinosa, y otro que contenía un promotor del gen lacZ dentro de un casete FRT. Las E. coli se cultivaron en placas de arabinosa a 37 °C y 40 °C, y si se producía la recombinación, la expresión de lacZ se atenuaba y las colonias aparecían blancas. Se seleccionaron las colonias blancas de cada generación y se cultivaron en una nueva placa de arabinosa a las mismas temperaturas anteriores durante ocho generaciones. Después de confirmar la recombinación mediante western-blotting y de secuenciar los genes mutados de FLP, esta octava generación de la proteína FLP (FLPe) se transfectó en cultivos celulares de mamíferos, y se confirmó la recombinación en células de mamíferos. Esta variante de FLP sólo tiene 4 sustituciones de aminoácidos: P2S, L33S, Y108N y S294P.
Generación de mosaicos genéticosEditar
El mosaicismo genético se produce dentro de un organismo cuando tipos celulares similares expresan fenotipos diferentes debido a genotipos disímiles en loci específicos. En pocas palabras, esto ocurre cuando un organismo contiene diferentes genotipos, lo que suele ser raro en la naturaleza. Sin embargo, esto puede producirse fácilmente (y de forma problemática) utilizando la recombinación FLP-FRT. Si en una célula hay dos sitios FRT diferentes, y el FLP está presente en concentraciones adecuadas, el casete FRT continuará siendo extirpado e insertado entre los dos sitios FRT. Este proceso continuará hasta que las proteínas FLP caigan por debajo de las concentraciones requeridas, dando lugar a que las células de un organismo posean diferentes genotipos. Esto se ha observado desde moscas de la fruta hasta ratones y es indiscriminado contra cromosomas específicos (somáticos y sexuales) o tipos de células (somáticas y de la línea germinal).
Determinación de linajes celularesEditar
Antes de la publicación de Dymecki et al. (1998), la recombinasa Cre se había utilizado para el mapeo del destino celular de los progenitores neuronales en ratones utilizando el promotor En2. Por lo tanto, los autores de Dymecki et al. (1998) teorizaron que la recombinasa FLP podría utilizarse de forma similar con una eficacia parecida a la de la recombinasa Cre en ratones. Los autores crearon dos líneas de ratones transgénicos: una línea de fusión neuronal Wnt1::Flp y una línea que poseía el casete FRT flanqueando el exón 18 de tm1Cwr. Los autores eligieron este exón para la escisión porque si se extirpa, su resultado es un fenotipo nulo. Los autores aparearon las dos líneas y dejaron que la progenie alcanzara la edad adulta antes de sacrificarla. Se extrajo el ARN del tejido neuronal, muscular, entérico y de la cola. La PCR de transcripción inversa y el northern blotting confirmaron la escisión del 18º exón de tm1Cwr de forma abundante en el tejido cerebral y de forma moderada en el tejido muscular (debido a las células de Scwhann dentro del músculo). Como se esperaba, la escisión no se observó en otros tejidos. Los autores vieron una eficiencia igual, si no mejor, de la recombinasa FLP en la determinación del destino celular que la recombinasa Cre.
En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)Edit
Hasta la fecha, la recombinasa Flp se ha utilizado muchas veces en D. melanogaster. Una comparación de la recombinasa Flp con la recombinasa Cre en D. melanogaster fue publicada por Frickenhaus et al. (2015). Los autores de Frickenhaus et al. (2015) tenían un doble objetivo: caracterizar y comparar la eficacia del «knock-out» de la recombinasa Flp con el «knock-out» de la recombinasa Cre y el knockdown por RNAi y revelar la función de cabeza (caz), el ortólogo de la mosca a FUS, en las neuronas y el tejido muscular de D. melanogaster. El FUS ha sido fuertemente implicado en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal en humanos. Los autores utilizaron un sistema elav-Gal4/UAS-Flp o Cre para expresar la recombinasa específicamente en las neuronas y un sistema Mef2-Gal4/UAS-Flp o Cre para expresarla específicamente en los músculos. Los autores concluyen que la herramienta de «knock-out» de la recombinasa Flp es más eficaz que el ARNi y la recombinasa Cre para eliminar genes específicos en tejidos o líneas celulares concretos, debido a la ausencia de la expresión de fuga que se observa tanto en la proteína Cre como en el transcrito del ARNi. Además, los autores observaron una toxicidad de la proteína Cre que no se observa con la proteína Flp.
En Danio rerio (pez cebra)Edit
La eficacia del sistema de recombinasa FLPe fue evaluada en el pez cebra por Wong et al. (2009). Los embriones, que eran hemizigotos para una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) flanqueada por el FRT, aguas abajo de un promotor específico del músculo, fueron inyectados con la proteína FLPe. Sin la FLPe, estos embriones deberían expresar la EGFP en todo el tejido muscular, y si se cruzan con una cadena de tipo salvaje, el 50% de la progenie resultante también debería expresar la EGFP en el tejido muscular. Los embriones inyectados con FLPe tenían una expresión significativamente reducida de EGFP en el tejido muscular, y también se observó mosaicismo. Cuando estos embriones alcanzaron la edad adulta, se aparearon con una cepa de tipo salvaje, y las nidadas resultantes tenían una progenie significativamente menor que expresaba la EGFP en el tejido muscular (0-4%). Estos resultados demuestran que el FLPe no sólo es muy eficaz en las células somáticas, sino también en la línea germinal del pez cebra,
En las plantasEditar
Creación de «fitosensores» o «centinelas» en Arabidopsis thaliana y TabacoEditar
Los fitosensores son plantas modificadas genéticamente que pueden informar de la presencia de contaminantes bióticos o abióticos. Obviamente, la producción de estas plantas modificadas tiene una gran promesa agrícola y de laboratorio. Sin embargo, la creación de un vector reportero adecuado ha demostrado ser problemática. Los elementos reguladores cis desempeñan un papel importante en la activación transcripcional de los genes en las plantas, y muchos de ellos no se conocen bien. Muchos fitosensores no expresan sus genes reporteros o dan falsos positivos debido a los promotores sintéticos. Los autores de Rao et al. (2010) utilizaron la herramienta recombinasa FLP para la producción de un fitosensor altamente eficiente. Los autores utilizaron un promotor de choque térmico para inducir la producción de FLP mientras que un vector flanqueado por FRT separaba el promotor CaMV 35S del gen de la beta-glucuronidasa (GUS). Cuando las plantas fueron expuestas al choque térmico, la inducción de FLP condujo a la escisión del vector flanqueado por FRT, desplazando efectivamente el gen GUS directamente aguas abajo del promotor CaMV 35S. La activación de GUS hizo que las hojas de las plantas cambiaran de color verde a azul; ¡así, el fitosensor informó eficazmente del estrés al sistema modelo!
Con Cre-recombinasaEditar
Producción del sistema de expresión de ARNmi inducible por puerta (GRIM)Editar
El ARN de interferencia (ARNi) ha provocado un cambio de paradigma en la expresión de genes y en los potenciales knockouts de genes en eucariotas. Antes de la producción del sistema de expresión GRIM, la creación de vectores de ARNi era costosa y requería mucho tiempo. Los vectores se producían por el método tradicional de clonación molecular de copiar y pegar. Garwick-Coppens et al. (2011) desarrollaron un método mucho más eficiente para la producción de vectores de ARNi en el que la expresión del ARNi puede ser eliminada usando Cre-recombinasa y eliminada usando Flp-recombinasa. El novedoso sistema de expresión GRIM permite generar mucho más rápidamente vectores de expresión que contienen construcciones de ARNi artificial. Los autores demostraron que su sistema de expresión funciona con bastante eficacia en células de riñón embrionario humano (HEK), una línea celular humana inmortalizada habitual en la investigación molecular.