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Resultados representativos

La capacidad de los ensayos de placas para evaluar con precisión los títulos virales depende de numerosos factores: la selección adecuada de la célula huésped, los medios y las condiciones de crecimiento apropiados para la viabilidad celular y viral, la propagación viral inmovilizada y la determinación precisa del período de incubación viral para permitir un tiempo adecuado para la formación de placas distintas y contables.

Para este estudio, se eligieron virus de tres familias representativas para demostrar las diferencias en: la selección de la superposición, los periodos de incubación y la morfología de la placa en diferentes tipos de muestras. Se seleccionó la encefalitis equina venezolana (VEEV) como modelo viral (+)ssRNA, que puede causar una enfermedad importante en las especies equinas y en los seres humanos y representa la familia Togaviridae. La cepa de influenza B de Taiwán, un virus segmentado (-)ssRNA que infecta principalmente a los humanos, representa la familia Orthomyxoviridae. El virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), un virus nacido de artrópodos (-)ssRNA que infecta principalmente a artrópodos, rumiantes y humanos, fue seleccionado como representante de la familia Bunyaviridae.

Para el RVFV (Figura 1), se determinaron los títulos a partir de una solución madre de una cepa viva atenuada MP12 recombinante del RVFV en un formato de placa de 12 pocillos utilizando superposiciones de CMC, agarosa o Avicel que se incubaron una al lado de la otra durante 72 horas después de la infección (hpi). Una placa representativa que muestra diluciones que van de 10-4 a 10-7 se puede ver en el panel A. Las placas que utilizan superposiciones de CMC y agarosa mostraron placas pequeñas, claras y distintas con un borde circular bien definido. Las placas con una superposición líquida eran ligeramente más abundantes y más grandes en comparación con las placas de agarosa y CMC, y ofrecían un borde menos definido. Se compararon los títulos virales en el panel B y todos los recubrimientos tuvieron un rendimiento comparable.

Para obtener una comparación visual más clara entre los recubrimientos para MP12 junto con un tamaño de muestra mayor para determinar la reproducibilidad, también se probó una placa de 6 pocillos por triplicado (Figura 2). En el formato de placa de 6 pocillos, el uso de una superposición de CMC mostró placas más pequeñas que las superposiciones de agarosa o líquidas, que eran comparables en tamaño entre sí. Aunque los títulos virales fueron similares entre las tres superposiciones (Panel D), las placas formadas en las superposiciones de agarosa y líquidas resultaron más fáciles de contar debido a su mayor tamaño.

En contraste con el RVFV, los títulos del VEEV y la morfología de las placas entre las diferentes superposiciones variaron notablemente (Figura 3A). Las placas formadas en las superposiciones de CMC demostraron una morfología clara y distinta cuando se utilizó un formato de placa de 12 pocillos, a expensas del tamaño de la placa y la sensibilidad (panel B). En contraste con la CMC, el uso de superposiciones de agarosa y líquido dio lugar a placas significativamente más grandes, lo que indica una menor inhibición viral y una mayor sensibilidad a la replicación del VEEV. Esto se confirmó previamente cuando se comparó únicamente la agarosa frente a la CMC en un artículo publicado por Juárez et al.4. Aunque la agarosa y las superposiciones líquidas produjeron placas más grandes que la CMC, las placas tenían bordes mal definidos y eran difíciles de contar en un formato de 12 pocillos, y las superposiciones líquidas proporcionaban la mayor difusión de los bordes. Cuando se probaron las placas en placas de 6 pocillos (Figura 4), el formato más grande de 6 pocillos anuló el problema de las placas abiertamente grandes que eran difíciles de diferenciar en el formato de 12 pocillos, y las superposiciones de agarosa y líquidas demostraron ser superiores a las superposiciones de CMC en términos de definición de la placa y de sensibilidad (Figura 4D).

En comparación con el RVFV o el VEEV, la gripe plantea varios retos únicos cuando se forman placas, como el requisito de una proteasa externa. La sensibilidad del virus de la gripe a diferentes selecciones de superposición también ha sido bien documentada en el pasado, ya que se han observado cambios significativos cuando se han utilizado modificaciones tan pequeñas como diferentes marcas de agarosa9.

Es interesante que para la cepa de la gripe B de Taiwán, el uso de CMC como superposición dio lugar a placas notablemente más pequeñas que fueron difíciles de contar y resultaron difíciles de puntuar de forma fiable (Figura 5A). El uso de una superposición de agarosa proporcionó las mejores placas (panel C), y dio lugar a una tinción de fondo más oscura (probablemente debido a una mayor viabilidad de la monocapa), y mostró placas más claras y nítidas en comparación directa con el uso de la superposición líquida (panel B).

Una clara ventaja de los polímeros líquidos sobre las superposiciones sólidas y semisólidas, como la agarosa y la CMC, radica en la facilidad de extracción y aplicación. Los recubrimientos semisólidos requieren calentamiento, y la solidificación puede resultar problemática a la hora de manipularlos y retirarlos. Para aprovechar estas ventajas y determinar la viabilidad de la utilización de Avicel en un alto rendimiento para el RVFV, se probó un formato de placa de 96 pocillos con diferentes concentraciones de recubrimiento (Figura 6). Para el RVFV MP-12, se realizaron diluciones por cuadruplicado con concentraciones finales de Avicel de 0,6 y 1,2%. La aplicación y la eliminación de la superposición resultaron sencillas, sin que se observaran diferencias aparentes entre las réplicas o entre las concentraciones, lo que demuestra un alto grado de reproducibilidad. Al puntuar, las placas eran distintas y contables a simple vista, lo que demuestra la viabilidad de utilizar superposiciones líquidas de una manera de alto rendimiento para el RVFV.

Figura 1:Comparaciones de superposición de placas de RVFV utilizando placas de 12 pocillos. Se sembraron Veros a 2,5 x 105 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 µl utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de MP12. Después de la infección, se aplicaron 1,5 ml de superposiciones de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% (concentraciones finales) para comparar directamente las superposiciones, tal como se demuestra en el panel A. Se contaron las placas y se las tituló en el panel B.

Figura 2: Comparaciones de superposición de placas de RVFV utilizando placas de 6 pocillos. Se sembraron Veros a 5 x 105 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 µl utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de MP12. Se aplicaron tres ml de superposición de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% para comparar directamente las superposiciones, como se demuestra en los paneles A, B y C. Se llevaron a cabo experimentos separados de forma idéntica a los descritos para los paneles A-C, con recuento y titulación de las placas en el panel D (N = 3).

Figura 3: Comparaciones de superposición de placas de VEEV utilizando placas de 12 pocillos. Se sembraron Veros a 2,5 x 105 células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 µl utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de la cepa vacunal VEEV TC-83. Después de la infección, se aplicaron 1,5 ml de superposición de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% para comparar directamente las superposiciones, como se demuestra en el panel A. Las placas se contaron y se titulan en el panel B.

Figura 4: Comparaciones de superposición de placas de VEEV utilizando placas de 6 pocillos. Se sembraron Veros a 5 x 105 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 µl utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de VEEV TC-83. Después de la infección, se aplicaron 3 ml de superposiciones de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% para comparar directamente las superposiciones, como se demuestra en los paneles A, B y C. Se llevaron a cabo experimentos separados de forma idéntica a la descrita para los paneles A – C, con placas contadas y tituladas en el panel D (N = 3).

Figura 5: Comparaciones de superposición de placas de gripe. Las células MDCK se sembraron a 5 x 105 células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 µl de inóculo utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de Influenza B Taiwán. No se utilizó suero fetal bovino (FBS) en los medios de crecimiento ni en las superposiciones, ya que el FBS puede inhibir la propagación de la Influenza a través de la inhibición de ciertas proteasas que son necesarias para la fusión viral. Se añadió TPCK-tripsina a todas las superposiciones antes de su aplicación para facilitar la fusión y la entrada del virus en las células huésped. Después de la infección, se aplicaron 3 ml de superposiciones de agarosa al 0,3%, Avicel al 0,6% o CMC al 1% con el fin de comparar directamente las superposiciones, como se demuestra en los paneles A, B y C. Se llevaron a cabo experimentos separados de forma idéntica a los descritos en los paneles A – C, con el recuento y la titulación de las placas en el panel D (N = 3). Aunque se tomó una media para las placas CMC, éstas resultaron difíciles de contar de forma fiable, ya que mostraban bordes difusos y tamaños de placa muy pequeños.

Figura 6:Superposición de placas de alto rendimiento. Una placa de 96 pocillos de Veros chapada a 3 x 104 células por pocillo, se infectó con 50 µl de inóculo utilizando la misma muestra inicial diluida en serie de RVFV MP12 durante 1 hora, por cuadruplicado. Para las superposiciones, se probaron concentraciones finales de 0,6 y 1,2% de Avicel con el fin de determinar la viabilidad y reproducibilidad de la utilización de superposiciones líquidas de una manera de alto rendimiento, Paneles A y B.

Tabla 1:Condiciones de inoculación de la placa y tipos de células

Tabla 2:Placa y medios de crecimiento viral/celular

Las soluciones de incubación no caducarán cuando se realicen mientras se mantenga la esterilidad.

Tabla 3:Stock de superposiciones

Tabla 4: Formatos de placas