Un procedimiento general de blotting comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizada o de células. A continuación, el ARNm eucariota puede aislarse mediante el uso de cromatografía de celulosa oligo (dT) para aislar sólo los ARN con una cola de poli(A). A continuación, las muestras de ARN se separan mediante electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas no pueden entrar en la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por tamaño, se transfieren a una membrana de nylon mediante un sistema capilar o de blotting al vacío.
Sistema de blotting capilar para la transferencia de ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de blotting.
Una membrana de nylon con carga positiva es la más eficaz para su uso en el northern blotting ya que los ácidos nucleicos con carga negativa tienen una alta afinidad por ellas. El tampón de transferencia utilizado para el blotting suele contener formamida porque disminuye la temperatura de recocido de la interacción sonda-ARN, eliminando así la necesidad de altas temperaturas, que podrían causar la degradación del ARN. Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza mediante la unión covalente a la membrana por medio de luz UV o calor. Una vez marcada la sonda, se hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar a la eficacia y especificidad de la hibridación incluyen la fuerza iónica, la viscosidad, la longitud del dúplex, los pares de bases no coincidentes y la composición de las bases. La membrana se lava para asegurar que la sonda se ha unido específicamente y para evitar que surjan señales de fondo. A continuación, las señales híbridas se detectan mediante una película de rayos X y pueden cuantificarse mediante densitometría. Para crear controles para la comparación en un northern blot, pueden utilizarse muestras que no muestren el producto génico de interés después de la determinación mediante microarrays o RT-PCR.
GelesEditar
RNA corrido en un gel de agarosa con formaldehído para resaltar las subunidades ribosómicas 28S (banda superior) y 18S (banda inferior).
Las muestras de ARN se separan normalmente en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizador del ARN para limitar la estructura secundaria. Los geles pueden teñirse con bromuro de etidio (EtBr) y visualizarse bajo luz ultravioleta para observar la calidad y la cantidad de ARN antes del secado. La electroforesis en gel de poliacrilamida con urea también puede utilizarse en la separación del ARN, pero se usa más comúnmente para el ARN fragmentado o los microARN. A menudo se corre una escalera de ARN junto a las muestras en un gel de electroforesis para observar el tamaño de los fragmentos obtenidos, pero en las muestras de ARN total las subunidades ribosómicas pueden actuar como marcadores de tamaño. Dado que la subunidad ribosómica grande es la 28S (aproximadamente 5kb) y la subunidad ribosómica pequeña es la 18S (aproximadamente 2kb) aparecen dos bandas prominentes en el gel, la más grande con una intensidad cercana al doble de la más pequeña.
SondasEditar
Las sondas para northern blotting están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del ARN de interés, pueden ser de ADN, ARN u oligonucleótidos con un mínimo de 25 bases complementarias a la secuencia diana. Las sondas de ARN (riboprobes) que se transcriben in vitro son capaces de soportar pasos de lavado más rigurosos evitando parte del ruido de fondo. Comúnmente, el ADNc se crea con cebadores etiquetados para la secuencia de ARN de interés para que actúe como sonda en el northern blot. Las sondas deben marcarse con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, en la que la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante (HRP) descomponen los sustratos quimioluminiscentes produciendo una emisión de luz detectable. El etiquetado quimioluminiscente puede producirse de dos maneras: o bien la sonda está unida a la enzima, o bien la sonda está marcada con un ligando (por ejemplo, biotina) para el que el ligando (por ejemplo, avidina o estreptavidina) está unido a la enzima (por ejemplo, HRP). La película de rayos X puede detectar tanto las señales radiactivas como las quimioluminiscentes y muchos investigadores prefieren las señales quimioluminiscentes porque son más rápidas, más sensibles y reducen los riesgos para la salud que conllevan las etiquetas radiactivas. La misma membrana puede sondearse hasta cinco veces sin una pérdida significativa del ARN objetivo.