Muestras FFPE – Preparación de muestras de tejido humano – Lab-Ally

Tabla de contenidos

Introducción |Adquisición de tejidos |Procesamiento de tejidos FFPE |Seccionamiento | Referencias

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Introducción

Muchos de los investigadores actuales prefieren utilizar muestras de tejidos FFPE para sus análisis de IHC, histológicos o genómicos in situ. FFPE significa «Formalin-Fixed Paraffin-Embedded» y describe las dos características clave de este método de conservación de tejidos. La formalina es una solución de formaldehído y se utiliza desde que el médico alemán Ferdinand Blum descubrió a finales del siglo XIX los efectos conservantes del formaldehído (Fox, et al., 1985). La parafina se infunde en el tejido tras la fijación con formaldehído, y el tejido también se rodea con una cubierta de parafina para ayudar a sostenerlo y protegerlo de la oxidación. Las muestras FFPE fijadas e incrustadas profesionalmente y las biomoléculas que contienen son razonablemente estables a temperatura ambiente. Estructuralmente, los tejidos fijados e incrustados son resistentes y pueden utilizarse para estudios de anatomía microscópica casi indefinidamente, pero con el tiempo, la antigenicidad de algunas proteínas se degradará limitando los estudios de IHC a muestras de no más de unas décadas. El ADN de doble cadena es sorprendentemente estable en los bloques de FFPE, pero otras biomoléculas menos estables, como el ARN, pueden degradarse en una década o menos, especialmente una vez que se han cortado las secciones.

Los archivos que acumulan un gran número de muestras de FFPE son una fuente de datos especialmente rica cuando se desea comparar muchos casos (es decir, muestras de FFPE de múltiples donantes) para sacar conclusiones estadísticamente sólidas sobre las características de determinadas indicaciones. Si las muestras de FFPE se van a utilizar en investigaciones biomédicas de «alto riesgo», es importante que cada etapa del proceso de preparación sea realizada por profesionales plenamente capacitados y certificados, preferiblemente en un laboratorio certificado por la CLIA (es decir, inspeccionado por el gobierno) o acreditado por el CAP (College of American Pathologists).

Hay que tener en cuenta que el proceso de FFPE no está estandarizado universalmente, y que las instituciones de todo el mundo pueden utilizar protocolos ligeramente diferentes con distintas soluciones de formol o adaptar el proceso a sus preferencias y requisitos. Lo que sigue es una visión general del proceso y descripciones de lo que implica cada paso, así como algunas variaciones comunes.

Adquisición de tejidos

Antes del procesamiento de tejidos está el paso necesario de adquisición de tejidos. En realidad, este es el elemento más difícil de controlar porque está entrelazado con la atención al paciente, el cumplimiento del 41CFR46 y, en los Estados Unidos, la supervisión de la junta de revisión interna (IRB). Los detalles del procedimiento médico y las convenciones de la atención estándar son importantes porque pueden afectar a variables como los intervalos de tiempo entre la administración de la anestesia y la ligadura de los vasos, la extracción del tejido y el tiempo transcurrido antes de la fijación, cualquiera de los cuales puede afectar a la calidad de la muestra. Por ejemplo, es probable que se produzcan cambios en el ARN y las proteínas durante el intervalo de tiempo, conocido como tiempo de isquemia caliente, entre la ligadura del suministro de sangre y la extracción del tejido (Dash, et al., 2002). Este tiempo de isquemia puede oscilar entre minutos y horas, dependiendo del órgano, los procedimientos operativos estándar de la institución, el cirujano y el resto del personal sanitario implicado, y el enfoque quirúrgico. Por esta razón, se ha recomendado que se registre este tiempo para cada muestra y que se mantenga al mínimo (Hewitt, et al., 2008).

Procesamiento de tejidos de fibroblastos

Una vez adquirida la muestra de tejido, puede ser necesario realizar un triaje adicional, una disección o una microdisección (denominados colectivamente «grossing») para aislar y preparar la porción específica de tejido que pasará por los pasos de procesamiento restantes. En la actualidad, el procesamiento de tejidos suele estar completamente automatizado hasta el último paso, la incrustación, que puede realizarse manualmente. Hay muchos procesadores de tejidos disponibles, pero todos seguirán la secuencia de los cuatro primeros pasos mostrados anteriormente. La automatización de los distintos pasos ayuda a eliminar las variaciones en el procedimiento como fuente de variación de los resultados experimentales entre diferentes muestras FFPE.

Fijación

La fijación es el paso inicial en el procesamiento de tejidos FFPE. Los factores críticos a tener en cuenta son la solución que se va a utilizar, el tiempo permitido para la fijación y el grosor y las propiedades histológicas de la muestra de tejido que se va a fijar.

– Solución

El fijador que se utiliza en la mayoría de los laboratorios es formalina neutra al 10%. La formalina es un líquido que contiene un 37-40% de formaldehído y un 10% de metanol (en peso) en agua; por lo tanto, una solución de formalina al 10% contiene aproximadamente un 3,7% – 4% de formaldehído y un 1% de metanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). En realidad, el formaldehído existe en solución principalmente como monómeros o pequeños polímeros de metilenglicol (metanediol, monohidrato de formaldehído) que se forma por la reacción reversible del formaldehído con el agua. Los polímeros de metilenglicol de alto peso se denominan paraformaldehído y se precipitan fuera de la solución, pero el metanol ralentiza este proceso de polimerización, que es la razón de su inclusión en las soluciones de formalina. La formalina diluida con agua (como la formalina al 10%) -y especialmente si se trata de una solución tampón- contendrá principalmente monómeros, ya que el gran número de moléculas de agua rompe cualquier polímero de metilenglicol que hubiera existido normalmente en una solución de mayor concentración de formaldehído (Kiernan, 2000). También se añaden tampones, el componente restante de la formalina, porque el formaldehído tiene tendencia a oxidarse en ácido fórmico (Fox, et al., 1985). El ácido fórmico en la fijación de tejidos puede dar lugar a la precipitación de gránulos de pigmento de formalina (hematina ácida) que pueden parecerse a los pigmentos producidos por algunos parásitos (Pizzolato, 1976). La amortiguación de la formalina evita que esto ocurra. Los agentes amortiguadores comunes incluyen carbonato de magnesio, carbonato de calcio, citrato, Tris y tampones de fosfato (Hewitt, et. al., 2008). El formol comercial suele contener tampones de fosfato. «Con tampón neutro», que es la forma típica en que se prepara la formalina, significa simplemente que el pH se mantiene en torno a 7.

– Proceso y mecanismo

Debido a los bajos pesos moleculares del formaldehído y el metilenglicol, la formalina (principalmente el metilenglicol en solución) penetra en los tejidos con relativa rapidez, a una velocidad que depende del tipo de tejido, pero con una tasa media de 1 mm/hora (Hewitt, et al., 2008). Por tanto, los protocolos de fijación variarán en función del tipo de tejido que se vaya a fijar. Una vez dentro del tejido, la fracción de moléculas de formaldehído que están presentes en la solución comenzarán a reticularse con las proteínas, pero esto ocurre a una velocidad mucho más lenta que la velocidad de difusión. La reacción del formaldehído con el tejido lo saca de la solución y tira de esa reacción reversible de formaldehído a metilenglicol en la dirección del formaldehído, de modo que se produce más cantidad de éste incluso cuando se consume (Fox, et al., 1985). Las cadenas laterales de aminoácidos de la lisina son las más reactivas con el formaldehído, pero otras que son algo reactivas con el formaldehído son la arginina, la asparagina, la histidina, la glutamina, la serina y la tirosina (Howat y Wilson, 2014). Tras la reacción, el grupo hidroximetilo resultante unido al complejo puede seguir reaccionando con la misma proteína u otras proteínas, formando así puentes de metileno estables (proteína-CH2-proteína) (Kiernan, 2000). Esto es lo que produce la insolubilidad y la rigidez de los tejidos que han sido fijados con formalina y así conservados. Se requieren alrededor de 24-48 horas para que esta reticulación se produzca suficientemente en todo el tejido (Thavarajah, et al., 2012), pero se ha recomendado que no se permitan más de 36 horas para este proceso, ya que la fijación durante un período de tiempo más largo disminuirá la calidad de las biomoléculas en las muestras FFPE, como por ejemplo acortando la longitud de los ácidos nucleicos que se pueden extraer (Hewitt, et al., 2008).

– Limitaciones

La principal ventaja de utilizar formaldehído -especialmente en forma de formalina neutra al 10%- es que preserva una amplia gama de tejidos y componentes. Sin embargo, tiene limitaciones. Por ejemplo, para la microscopía electrónica se suele utilizar una combinación de formaldehído con glutaraldehído (C5H8O2), o una solución de glutaraldehído sola (Kiernan, 2000), ya que esas soluciones son mejores para preservar las estructuras de los tejidos para ese fin. Obsérvese que los tejidos preparados con una solución de glutaraldehído o de glutaraldehído-aldehído no se consideran muestras FFPE. Otro reto es la recuperación de moléculas de ADN y ARN de los tejidos FFPE, ya que el formol tiende a modificar los ácidos nucleicos -incluso hasta el punto de introducir mutaciones artificiales en el ADN- y a romperlos en pequeños fragmentos (Srinivasan, Sedmak y Jewell, 2002). Sin embargo, es posible extraer fragmentos de ADN y ARN del tejido FFPE que sean adecuados para el análisis, como se describe en un protocolo escrito por Tang, et al. (2009), siendo un factor clave en la recuperación del ácido nucleico la digestión adecuada de la proteasa. También existen kits comerciales para la extracción de ácidos nucleicos de muestras FFPE.

– Espesor de la muestra

Otro punto importante a tener en cuenta con respecto a la fijación con formalina es el espesor de la muestra de tejido. Aunque la formalina penetra en el tejido con relativa rapidez, como se ha mencionado anteriormente, el grosor del tejido afectará a la calidad de la muestra fijada. Se necesitará más tiempo para que el formol llegue al centro de las muestras de tejido más gruesas. Mientras que el formol se difunde gradualmente hacia el interior de la muestra, las regiones exteriores ya habrán comenzado el proceso de fijación, por lo que es más probable que las biomoléculas que allí se encuentran se degraden en el prolongado período de tiempo necesario para la fijación total. Además, si se respetan los límites de tiempo (como un máximo de 36 horas, como se ha mencionado anteriormente), existe la posibilidad de que la muestra de tejido no quede suficientemente fijada (conservada) en su totalidad. Por esta razón, los tejidos para la fijación que tienen una anchura superior a varios milímetros o tal vez uno o dos centímetros serían mejor disecados en segmentos más finos para una fijación óptima (Hewitt, et al., 2008). Las instituciones pueden tener diferentes protocolos para el tiempo y el volumen de fijador necesarios para las muestras de tejido de diferentes anchuras, pero en general la relación entre el volumen de fijador y el volumen de tejido debe ser de 10:1 (Klatt, 2016).

Deshidratación

El segundo paso en el procesamiento de las muestras FFPE es la deshidratación. Dado que la parafina es inmiscible con el agua, se debe eliminar toda el agua de la solución de formol del tejido antes de que la parafina pueda infiltrarse en él. Se utilizará una serie de soluciones de alcohol (a menudo etanol), comenzando frecuentemente con alcohol al 70% y progresando hasta el 100%, para eliminar esencialmente toda el agua del tejido. Para una deshidratación óptima es necesario utilizar soluciones nuevas o reemplazar con frecuencia las soluciones utilizadas, ya que el alcohol se diluye cada vez más con el uso. También es imperativo que este paso se complete por completo (con el tiempo suficiente reservado para este paso) porque una deshidratación insuficiente puede conducir a la degradación del tejido (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Despejar

Como la parafina en realidad tampoco es miscible en alcoholes, el siguiente paso es eliminar el alcohol con una sustancia que sea miscible con la parafina. Este paso se conoce como aclaración, y el xileno es el agente de aclaración más utilizado (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Infiltración de parafina

Después de una adecuada fijación, deshidratación y aclaración, el tejido puede someterse finalmente a la infiltración (o impregnación) de parafina. Este paso tampoco está estandarizado, y las instituciones de todo el mundo pueden utilizar diferentes parafinas y mezclas de cera de composición variada. Las parafinas tienen diferentes puntos de fusión y texturas que repercuten en el bloque de tejido final y sus características. En los Estados Unidos, así como en Europa Occidental, se utilizan normalmente parafinas sintéticas con puntos de fusión bajos (55°C-63°C) para obtener los mejores resultados. El látex, el sulfóxido de dimetilo y los «plastificantes» patentados pueden incluirse en la formulación para modificar la textura y la maleabilidad de la muestra de tejido final (Hewitt, et al., 2008).

Los países de otras partes del mundo suelen incorporar cera de abejas en sus formulaciones para mejorar la maleabilidad y disminuir la temperatura de fusión de las parafinas de baja calidad utilizadas. Sin embargo, la cera de abejas contiene contaminantes, como el polen, y disminuye la calidad de la muestra final. Deben evitarse las temperaturas de fusión más elevadas, ya que posteriormente dan lugar a una desparafinación menor e insuficiente de la muestra de tejido, así como a una disminución de la cantidad de ácidos nucleicos recuperados del tejido (Hewitt, et al., 2008).

Incorporación en parafina

El último paso en el procesamiento de las muestras FFPE es la incrustación en parafina. La muestra de tejido infiltrada en parafina se rodea con una capa de parafina. Hay que tener cuidado de orientar correctamente el bloque de tejido en el molde («cassette») porque esto influye en el plano de seccionamiento cuando se cortan secciones finas del bloque con un microtomo (Klatt, 2016). Una vez que la cubierta de parafina se ha solidificado, el bloque FFPE está listo para su almacenamiento y se mantendrá bien conservado durante años, incluso hasta décadas (Hewitt, et al., 2008).

Seccionamiento

Una vez que el tejido está incrustado, está listo para el seccionamiento en el microtomo. Dado que el tejido no siempre está completamente plano contra el frente de la parafina, el histotecnólogo normalmente debe «encarar» el bloque. El bloque de tejido se coloca en el soporte de bloques del microtomo y, mientras ajusta el ángulo del soporte de bloques para desperdiciar la menor cantidad de tejido posible, el histotecnólogo gira el volante, moviendo el bloque hacia arriba y hacia abajo contra una cuchilla afilada. El bloque se corta hasta que una sección representativa completa del tejido se encuentra en el frente del bloque. Una vez enfrentado el tejido, el bloque se pone en hielo para que se enfríe, lo que ayudará a facilitar el corte de secciones finas; la parafina demasiado caliente creará tejido comprimido con secciones arrugadas. Cuando el bloque se ha enfriado, se vuelve a colocar en el soporte de bloques. El técnico vuelve a girar el volante, esta vez a un ritmo lento y uniforme, para crear secciones finas consecutivas que se peguen entre sí, formando una «cinta».» La cinta se coloca en un baño de agua caliente (la temperatura se mantiene justo por debajo del punto de fusión de la parafina) para alisar las arrugas que se hayan formado. A continuación, el técnico coloca un portaobjetos de microscopio en el baño de agua y «recoge» la(s) sección(es) elegida(s) para que se adhiera(n) al portaobjetos.

El grosor más común de las secciones de tejido es de entre 3 y 5 micrómetros (o micras, para abreviar), que es el grosor de una sola célula. Los portaobjetos con secciones de 3-5 micras se utilizan normalmente para la tinción, ya sea la tinción estándar de hematoxilina &eosina (H&E), la tinción especial o la tinción inmunohistoquímica (IHC). Los investigadores suelen solicitar «rizos» en lugar de secciones finas en portaobjetos. Los rizos son secciones más gruesas (10 micras o más) que se colocan en tubos Eppendorf y se utilizan generalmente cuando es necesario extraer ARN o ADN de las muestras FFPE. Las secciones gruesas también pueden colocarse en portaobjetos en lugar de tubos; esto es óptimo cuando sólo se va a utilizar una parte del tejido para la extracción. En este caso, el tejido se raspa del portaobjetos y se coloca en un tubo. Las muestras FFPE que han sido seccionadas son estructuralmente estables y, si se tratan y almacenan adecuadamente, pueden utilizarse para el análisis microscópico durante algún tiempo después del seccionamiento, pero si se van a realizar extracciones químicas, generalmente las secciones deben utilizarse lo antes posible después del corte para evitar la degradación oxidativa y biológica de las moléculas objetivo expuestas.

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10. Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Escuela de Medicina de la Universidad de Mercer, Savannah. Recuperado de http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Consultado el 28 de diciembre de 2016