3.1 OMVs: Composición, Biogénesis y Roles Funcionales
Las OMVs son nanoestructuras esféricas bicapa resistentes y discretas, de entre 10 y 300 nm de diámetro, derivadas de la envoltura celular e incapaces de replicarse independientemente (Kulp y Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Fig. 4). El desprendimiento de las OMV se observó por primera vez hace más de 50 años en micrografías electrónicas de transmisión que representaban la ultraestructura de la pared celular bacteriana (Bladen y Waters, 1963; Bayer y Anderson, 1965; Chatterjee y Das, 1967). Se estableció que estas estructuras nanoesféricas comprendían una sola membrana que rodeaba un centro denso de electrones (Work et al., 1966). Otros estudios de la misma época también informaron de la presencia de «glóbulos extracelulares» en el sobrenadante libre de células de E. coli cultivadas en condiciones de crecimiento con limitación de nutrientes (Bishop y Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Por lo tanto, inicialmente se postuló que la formación de OMVs ocurría únicamente en condiciones de estrés. Sin embargo, investigaciones posteriores demostraron claramente que las OMV también podían detectarse en condiciones no estresantes, tanto en entornos de laboratorio como ambientales (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). Hoy en día, se sabe que las OMVs contribuyen a una miríada de funciones biológicas clave, y uno de los primeros papeles descritos para las OMVs es su participación en la patogénesis, particularmente como vehículos de entrega de factores de virulencia (revisado en Ellis y Kuehn, 2010). A lo largo de los años, se han atribuido funciones adicionales a las OMV, dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo, incluyendo la comunicación intra/inter-especie, la capacidad de respuesta a las tensiones envolventes, la adquisición de nutrientes, la transferencia horizontal de genes, la actuación como agentes «señuelo», así como los bienes públicos (para una descripción detallada, véase Kulp y Kuehn, 2010 y Schwechheimer y Kuehn, 2015). En general, las OMVs parecen promover la supervivencia de la bacteria dentro de un nicho ambiental específico, lo que destaca su relevancia para la homeostasis bacteriana.
Fig. 4. Vesículas de la membrana externa de bacterias Gram negativas. (A) Representación de una vesícula de membrana externa (OMV-panel superior) derivada de la envoltura celular bacteriana (panel inferior). Se muestran los detalles de la membrana externa (OM) y la membrana interna (IM), incluyendo las proteínas transmembrana. El espacio periplásmico, en el que se encuentra la capa de peptidoglicano (PG), muestra proteínas periplásmicas solubles, proteínas mal plegadas y ácidos nucleicos. El contenido del OMV ilustra parte de las biomoléculas que se han identificado tanto en su membrana como en su lumen. (B y C) Micrografías electrónicas de transmisión de una célula de Synechocystis sp. PCC 6803 teñida con acetato de uranilo negativo que libera una OMV (B, aumento de 120.000), y medio extracelular concentrado libre de células de Synechocystis sp. PCC 6803 que muestra varias OMV (C, aumento de 40.000).
(A)Basado en Jan, A.T., 2017. Vesículas de membrana externa (OMVs) de bacterias Gram negativas: una actualización de la perspectiva. Front. Microbiol. 8, 1053.
Numerosos estudios han demostrado que las OMVs están enriquecidas en componentes de la OM, concretamente LPS y OMPs, así como proteínas periplásmicas, fragmentos de PG, e incluso ácidos citoplásmicos y nucleicos (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). Los primeros informes no diferenciaban realmente las VM formadas artificialmente en solución (debido al comportamiento natural de los lípidos de reagruparse en vesículas, atrapando indiscriminadamente material procedente de la lisis bacteriana) de las OMV intactas. Más recientemente, las metodologías de aislamiento mejoradas y las técnicas ómicas más avanzadas han permitido un análisis cuidadoso de la composición de las OMV. Sorprendentemente, las OMVs están de hecho enriquecidas en componentes celulares específicos, mientras que están agotadas en otros (Lee et al., 2008), apoyando la idea de que la selección del contenido de la carga no es un proceso aleatorio. Por ejemplo, el contenido de las OMV de Salmonella sp. varió según las condiciones de crecimiento probadas: en las OMV aisladas de células en condiciones de abundancia de nutrientes, se detectaron preferentemente proteínas citosólicas implicadas en la traducción y el metabolismo celular, mientras que en condiciones nutricionales limitantes las OMV se enriquecieron en proteínas de membrana implicadas en el transporte de nutrientes (Bai et al., 2014). Además, un enfoque basado en la espectrometría de masas indicó que no se detectó ningún componente específico ampliamente conservado en las OMV (Schwechheimer et al., 2013), lo que apunta de nuevo a una composición variable. Con todo, se espera que las composiciones diferenciales de las OMV estén relacionadas con las particularidades de la envoltura celular dependiente de la cepa y con distintos nichos ecológicos (Yoon, 2016).
Se han propuesto tres mecanismos de formación de las OMV que no se excluyen mutuamente. En un modelo, la vesicación se produce cuando los enlaces cruzados covalentes entre las proteínas de la membrana y la capa de PG se rompen localmente, ya sea por una disminución temporal de la abundancia general de enlaces cruzados o por un desplazamiento localizado de enlaces cruzados, promoviendo el abombamiento de pequeñas porciones de OM. Otro modelo implica nanoterritorios periplásmicos en los que se acumulan proteínas mal plegadas y otros componentes de la envoltura (fragmentos de LPS o PG). Tras esta acumulación anormal y confinada de componentes celulares, la integridad de la envoltura disminuye localmente, lo que desencadena el sangrado de las porciones de la MO cargadas de contenido lumínico. Por último, también se ha propuesto que las características biofísicas particulares de ciertos lípidos de la MO pueden promover la vesiculación al señalar la integración específica de LPS o fosfolípidos, lo que conduce a alteraciones en la fluidez y flexibilidad de la membrana. También se supone que muchos otros factores afectan al tamaño, la tasa de producción y la composición de las OMV, y si existe un proceso de biogénesis de las OMV consensuado, no está totalmente caracterizado (Kulp y Kuehn, 2010; Schwechheimer y Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
En la investigación sobre cianobacterias, el campo de las OMV es todavía bastante reciente, y queda mucho por explorar. Esto queda especialmente bien ilustrado por el hecho de que la primera publicación dedicada exclusivamente al estudio de las OMV de cianobacterias data de 2014 (Biller et al., 2014). En este estudio pionero, no solo se demuestra que los cultivos controlados en laboratorio de la cianobacteria marina Prochlorococcus liberan continuamente OMV, sino también que estas vesículas pueden encontrarse en abundancia en las muestras de agua de mar. Además, se demostró que las OMVs de Prochlorococcus eran capaces de soportar el crecimiento de cultivos de bacterias heterótrofas, implicando a estas estructuras en los flujos de carbono marino. Además, se observaron interacciones fago-vesícula marinas, mostrando el potencial de las OMV para actuar como agentes «señuelo». En general, los autores ilustraron algunas de las funciones fundamentales de las OMV y sus innumerables implicaciones para los ecosistemas microbianos (Biller et al., 2014). En una publicación más reciente, se compararon las OMV de Prochlorococcus con las de otros tres heterótrofos marinos, en un intento de desvelar la frecuencia de empaquetamiento del ADN en vesículas y la variación entre los diferentes taxones (Biller et al., 2017). Al examinar la cantidad y la distribución del ADN asociado a las OMV, se demostró que el ADN se encapsula de forma diferencial dentro de las poblaciones de OMV y entre ellas. De forma más decisiva, este trabajo sugiere que el mecanismo que empaqueta el ADN en las OMVs no opera por igual en todas las bacterias (Biller et al., 2017). Además de Prochlorococcus y de las cepas marinas de Synechococcus, también se ha demostrado que otras cianobacterias forman y liberan OMVs, incluyendo la unicelular Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) y Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), la filamentosa Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al., 2017), y la filamentosa y formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) y Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Además de las funciones descritas anteriormente para las OMVs derivadas de cianobacterias marinas (Biller et al., 2014), se han propuesto otras funciones para estas vesículas extracelulares. La liberación de OMVs por parte de las cianobacterias podría funcionar como una eficaz vía de secreción. Se demostró que una cepa de Synechococcus sp. PCC 7002 modificada metabólicamente que carecía de dos genes de glucógeno sintasa, glgA-I y glgA-II, liberaba una cantidad significativamente mayor de OMV que la cepa de tipo salvaje (Xu et al., 2013). Los autores plantearon la hipótesis de que, como se observó que este mutante exportaba espontáneamente azúcares solubles al medio, las OMVs observadas podrían estar relacionadas con este mecanismo de secreción, aunque no se evaluó el contenido de azúcar de las OMVs observadas (Xu et al., 2013). Además, también se demostró que una cepa de Synechocystis sp. PCC 6803 que carece del homólogo TolC (esencial para los mecanismos de secreción dependientes de la membrana; véanse las Figs. 1 y 3) libera una cantidad significativamente mayor de OMVs que la cepa parental (Oliveira et al., 2016). Como la cepa tolC-knockout estaba muy deteriorada en la secreción de proteínas intracelulares, metabolitos y compuestos exógenos, se propuso que la hipervesiculación podría satisfacer la necesidad de secreción. En concordancia, también se ha sugerido que las OMV de las cianobacterias transportan el material necesario para el desarrollo de la biopelícula. Esto se propuso al observar vesículas derivadas de cianobiontes en el esporocarpo del helecho acuático Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Además, como se observó material genético dentro de esas vesículas, podrían ser vectores para la transferencia lateral de genes entre el cianobionte y el helecho (Zheng et al., 2009). Sin embargo, las OMVs de las cianobacterias también pueden funcionar como un mecanismo para disipar el estrés de la envoltura: Gonçalves et al. caracterizaron un conjunto de cepas de Synechocystis sp. PCC 6803 que carecían de varios componentes de la translocasa IM implicados en los sistemas de secreción dependientes de TolC (Gonçalves et al., 2018). Curiosamente, entre las diversas cepas que presentaban diferentes capacidades de liberación de OMVs, la tolC-knockout (la mayor productora de OMVs del estudio) era la única que mostraba niveles de transcripción notablemente altos de spy y degQ, que codifican proteínas implicadas en las respuestas al estrés de la envoltura, y sobreexpresión de Spy y DegP (Gonçalves et al., 2018). Así, los autores sugirieron que la deleción de tolC provoca estrés en la envoltura, y que la hipervesiculación en el tolC-knockout representa un mecanismo independiente para hacer frente a tales condiciones de estrés (Gonçalves et al., 2018).