La función de las proteínas chaperonas en el ensamblaje de los complejos proteicos implicados en los procesos de adhesión y fusión de gametos

Complejos multiproteicos en la capacitación de los espermatozoides y la interacción con la ZP

Al llegar al lugar de la fecundación, la ampolla, los espermatozoides deben atravesar dos barreras antes de fusionarse con la membrana plasmática del ovocito, u oolema. La primera de ellas es un estrato de células del cúmulo rico en ácido hialurónico que rodea al ovocito y la segunda es la matriz extracelular del propio ovocito, la ZP (Hartmann et al. 1972). A pesar del desarrollo de los sitios de unión de la ZP y del ácido hialurónico durante la espermatogénesis y de la adquisición del potencial de unión a medida que los espermatozoides transitan por el epidídimo, estas células requieren un período distinto de residencia dentro del tracto reproductivo femenino antes de poder participar con éxito en dichas interacciones (Austin 1951, Chang 1951). Los cambios colectivos que experimentan los espermatozoides dentro de este entorno, denominados capacitación, permiten a las células responder a las señales procedentes del complejo del cúmulo oocitario y completar un proceso de exocitosis acrosomal, haciéndolas competentes para la fusión con el oolema.

La ZP está compuesta por un conjunto de sulfoglicoproteínas, a saber, ZP1, ZP2 y ZP3, que están muy conservadas en la mayoría de las especies de mamíferos (aunque se ha informado de un ligando adicional, ZP4/B, en oocitos humanos y de cerdo) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). En general, se considera que estos ligandos rigen la unión de los espermatozoides en la mayoría de las especies (véase también Reid et al. (2011)). Sin embargo, cabe destacar que en la actualidad se siguen estudiando varios modelos sobre la identidad del receptor primario de los espermatozoides dentro de la ZP y los mecanismos por los que los espermatozoides se adhieren a esta matriz (véase también Visconti & Florman (2010)). Del mismo modo, las investigaciones sobre la identidad de los correspondientes receptores de superficie de los espermatozoides que reconocen los ligandos adecuados en la ZP tampoco han aportado respuestas definitivas. De hecho, hay una creciente literatura de knockouts murinos de candidatos a proteínas receptoras auspiciosas (incluyendo la β-1,4-galactosiltransferasa (GALT1), la arilsulfatasa A (ARSA) y la molécula de adhesión espermática 1 (SPAM1); para una lista completa, véase Ikawa et al. (2010)) que no consiguen dar lugar a una infertilidad completa (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Más bien, se muestran varios grados de capacidad de unión reducida, lo que plantea la posibilidad de que este proceso abarque un grado de redundancia funcional y que una serie de proteínas espermáticas actúen de forma concertada para mediar en la adhesión de ZP. La coordinación de la actividad de estas proteínas para asegurar interacciones productivas con las ZP está emergiendo como un importante foco de investigación.

En la mayoría de los mamíferos euterios, se cree que la capacitación del esperma se inicia por la activación de una vía mediada por el AMPc que culmina en la fosforilación de tirosina de múltiples proteínas del esperma (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Las chaperonas moleculares ocupan un lugar destacado entre este conjunto de proteínas, siendo la HSP90AA1, la HSP90B1 y la HSPD1 algunas de las proteínas que presentan fosforilación de tirosina como consecuencia de la capacitación (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). Los modelos actuales sugieren que la fosforilación de estas chaperonas durante la capacitación desencadena su papel activo en el ensamblaje de las proteínas de reconocimiento de ZP en complejos y/o la translocación de estos complejos a la superficie de los espermatozoides en preparación para la fertilización (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Además de este papel indirecto en la adhesión de los gametos, las chaperonas de la superficie de los espermatozoides también tienen supuestas funciones como moléculas de adhesión que median el reconocimiento de los sulfoglicolípidos durante la unión de los gametos (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Recientemente, la técnica de PAGE nativa azul (BN-PAGE), que se desarrolló originalmente para el análisis de los complejos multienzimáticos de la cadena de transporte de electrones (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), se ha adaptado para la evaluación de los complejos multiméricos de la superficie de los espermatozoides en ratones y humanos (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Esta técnica permite la resolución electroforética de complejos proteicos nativos que conservan su actividad biológica. En espermatozoides humanos y de ratón, el uso de BN-PAGE en paralelo con el Far-Western blotting con zonas enteras solubilizadas ha revelado varios complejos multiproteicos primarios que poseen afinidad por ZP homólogas (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Se ha informado de que uno de estos complejos comprende los componentes proteicos del complejo CCT/TRiC (CCT1-CCT8), una estructura de doble anillo que funciona como chaperona molecular con un papel clave en la regulación de la formación de complejos multiproteicos (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Pruebas presuntas en forma de ensayos de co-inmunoprecipitación, co-localización y ligadura de proximidad han identificado a la proteína de unión a ZP 2 (ZPBP2) como una de las proteínas cliente más convincentes para el complejo CCT/TRiC en espermatozoides maduros (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Originalmente implicada en la unión secundaria de ZP, un estudio más reciente ha demostrado que los ratones macho nulos para ZPBP2 son subfértiles y muestran defectos en la interacción y penetración de ZP (Lin et al. 2007). En ratones, hay pruebas adicionales de que ciertas subunidades del complejo CCT/TRiC se translocan a la superficie del esperma durante la capacitación del mismo (Dun et al. 2011).

Otra clase prominente de chaperonas que se ha identificado en la superficie del esperma y que está implicada en la regulación de las interacciones ZP es la familia HSP70 (Naaby-Hansen et al. 2010). Al igual que el complejo CCT/TRiC, las chaperonas de la familia HSP70 también tienen funciones bien documentadas en la facilitación tanto del transporte de proteínas transmembrana como del ensamblaje de complejos proteicos estables (Mayer & Bukau 2005). Un miembro de la familia HSP70 que muestra una expresión exclusiva (ratón) o predominante (humano) en los testículos parece ser esencial para la fertilidad masculina. De hecho, la expresión aberrante de esta chaperona, HSPA2, se ha correlacionado con un fenotipo de infertilidad masculina grave en humanos, que afecta específicamente a la capacidad de los espermatozoides para interactuar con ovocitos homólogos in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Tanto en los ratones como en los humanos, HSPA2 tiene un papel fundamental en la espermatogénesis, y la supresión selectiva de la proteína en la primera especie conduce a una detención temprana de este proceso y a una ausencia concomitante de espermatozoides (Eddy 1999). En los seres humanos, los niveles de expresión de HSPA2 se han correlacionado positivamente con el éxito de la fecundación in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) y, por lo tanto, supuestamente son capaces de predecir el estado de fertilidad de los hombres con un alto grado de precisión (Ergur et al. 2002).

La caracterización de HSPA2 en nuestro propio laboratorio ha revelado que esta chaperona está presente en el dominio acrosomal de los espermatozoides humanos y es un componente de al menos cinco complejos de proteínas de alta masa molecular (Redgrove et al. 2012), incluyendo un subconjunto de los que se ha demostrado previamente que poseen afinidad por ZP (Redgrove et al. 2011). En consonancia con estos datos, hemos conseguido pruebas de que el más dominante de los complejos HSPA2 contiene dos proteínas adicionales, ambas implicadas previamente en las interacciones esperma-zona (Redgrove et al. 2012). Además, de acuerdo con los resultados publicados por Huszar et al., hemos podido demostrar una reducción significativa de los niveles de HSPA2 en los espermatozoides de hombres con lesiones aisladas en su capacidad para participar en interacciones con ZP de ovocitos homólogos in vitro (Redgrove et al. 2012). Nuestro trabajo actual se centra en determinar si el déficit en la adhesión a ZP es el resultado de una formación aberrante de los sitios de unión a ZP en las primeras etapas de la espermiogénesis (Huszar et al. 2000) o puede ser el resultado de la incapacidad de HSPA2 para participar en los eventos de remodelación de la superficie de los espermatozoides durante la capacitación, como facilitar el montaje y/o la presentación de los receptores de ZP en la superficie de los espermatozoides en preparación para la interacción con ZP.

Además de nuestro propio trabajo sobre el ensamblaje de los complejos de la superficie espermática, Han et al. han identificado independientemente un complejo multiproteico alternativo cargado de chaperonas en la superficie de los espermatozoides de ratón. Curiosamente, como se ha documentado anteriormente, este complejo, compuesto por HSPA5, calnexina, proteína integral de membrana 2B y ADAM7, se ensambla aparentemente durante la capacitación (Han et al. 2011). Aunque la función de este complejo aún no se ha dilucidado del todo, la expresión de ADAM7 se ha relacionado con la presencia de otras proteínas ADAM, ADAM2 y ADAM3 (Kim et al. 2006), que son importantes para la adhesión de los espermatozoides a la ZP (Muro & Okabe 2011). Además, se sabe que HSPA5 participa en la promoción de la adhesión de los espermatozoides de alta calidad a las células epiteliales oviductales (OEC) en el istmo del tracto reproductor femenino. Se cree que la formación de este reservorio tiene efectos pro-supervivencia en términos de mantener a los espermatozoides en un estado quiescente no capacitado en preparación para la liberación del ovocito a la ampolla (Topfer-Petersen et al. 2002). Curiosamente, las chaperonas HSPD1 y HSPA5 también se han localizado en la superficie del OEC bovino y, por lo tanto, se han implicado en la unión espermatozoide-OEC (Boilard et al. 2004).

También en consonancia con nuestro propio trabajo, el complejo identificado por Han et al. ha demostrado residir en microdominios de membrana o balsas lipídicas, regiones especializadas de la membrana que proporcionan una plataforma para el ensamblaje funcional y la presentación de complejos multiproteicos (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). La partición de complejos de chaperonas en el entorno de la balsa también se ha observado para HSPA2 en espermatozoides humanos (Nixon et al. 2011) y para los componentes del complejo CCT/TRiC en espermatozoides de ratón (Dun et al. 2011). Estos dominios de membrana también comprenden un número de proteínas receptoras de ZP putativas adicionales, incluyendo GALT1, ZP3R y SPAM1, reforzando su papel en la remodelación de la superficie del esperma y en la unión de ZP (Fig. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). El mecanismo(s) por el que estas proteínas son reclutadas a las balsas lipídicas está aún por resolver; sin embargo, se ha informado que HSPA2 se une a través de su dominio ATPasa al 3′sulfogalactosilglicerolípido, la principal glicoproteína identificada dentro de las balsas lipídicas de los espermatozoides (Mamelak & Lingwood 2001).

Además del papel putativo de las balsas lipídicas en el reposicionamiento de complejos clave de chaperonas y proteínas receptoras de ZP, también hay pruebas convincentes de que muchos receptores putativos de ZP, como ARSA y ZP3R, así como varias chaperonas moleculares muestran una reubicación dependiente de la capacitación desde sitios intracelulares como el acrosoma a la superficie del esperma para preparar las células antes de sus interacciones con la ZP (Nixon et al. 2009). Se ha propuesto que el contacto íntimo entre la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática del espermatozoide está mediado por la unión de proteínas complementarias del receptor de la proteína de fijación del factor sensible a la N-etilmaleimida (SNARE), lo que lleva a la formación de poros de fusión que proporcionan una ruta para la migración de las enzimas a la superficie del espermatozoide antes de la pérdida completa del contenido acrosomal (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). En apoyo de este modelo, un estudio realizado por Brahmaraju et al. (2004) demostró que la administración de anticuerpos contra VAMP y SNAP en la vesícula acrosomal inhibía la unión espermatozoide-ZP en el ratón.

Este cebado progresivo de la superficie espermática ha suscitado preguntas sobre la naturaleza de todo o nada de la exocitosis acrosomal. Sin embargo, el ensamblaje funcional de los complejos SNARE también parece apuntalar los prolongados eventos de fusión de la membrana espermática que permiten una pérdida completa del contenido acrosomal (Tsai et al. 2010). Aunque está muy extendido que el contacto con la ZP inicia esta exocitosis acrosomal en la mayoría de las especies de mamíferos, varios estudios realizados en el ratón han demostrado que los espermatozoides que comienzan la exocitosis acrosomal antes del contacto con la ZP siguen siendo capaces de fecundar el ovocito (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Este fenómeno también puede darse en los espermatozoides de cobaya (Huang et al. 1981) y de hámster (Yanagimachi & Phillips 1984). Estos hallazgos sugieren un papel importante del cúmulo oóforo en el inicio de la reacción acrosómica y suscitan dudas sobre la capacidad de los estudios in vitro realizados con estructuras de la zona del ovocito denudada por el cúmulo para informar con precisión sobre la verdadera naturaleza de la reacción acrosómica y, de hecho, de la interacción con la ZP.

A pesar de esta controversia, las moléculas tipo chaperona también han sido implicadas en la exocitosis acrosomal en virtud de su capacidad para promover el ensamblaje de SNAREs que contienen glutamina (Q-SNAREs) y SNARES que contienen arginina (T-SNAREs) en complejos ternarios apretados (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Curiosamente, elegantes estudios en cerdos han demostrado que la capacitación induce el acoplamiento estable de la membrana plasmática de los espermatozoides con la membrana acrosomal externa en preparación para la fertilización (Tsai et al. 2010). Estudios más recientes realizados por Tsai et al. (2012) también han aportado pruebas de la presencia de vesículas mixtas unilamelares que, entre otras funciones importantes, permiten el reclutamiento de proteínas secundarias de unión a ZP en la superficie del espermatozoide y poseen un novedoso complejo SNARE trimérico formado por sintaxina 3, SNAP23, VAMP2 y una proteína adicional, la complexina 2. La energía liberada por la formación de estos complejos se utiliza a su vez para iniciar la fusión de membranas juntando la membrana plasmática y la membrana acrosomal interna del espermatozoide (Tomes et al. 2002). La finalización de este proceso es crítica en la exposición de los dominios del espermatozoide que participan en los eventos posteriores de la fertilización: la unión del oolema y la fusión.