Resumen
La decocción Xiao-Yao-San (XYS) es una fórmula de la medicina tradicional china. Este estudio tenía como objetivo investigar el efecto de XYS en las capacidades cognitivas y su mecanismo subyacente en ratas ovariectomizadas. Las ratas hembras Sprague-Dawley fueron ovariectomizadas y tratadas con XYS (3 g/kg o 9 g/kg) por sonda, con inyección subcutánea de 17-β estradiol (E2, 2 μg/kg) como control positivo del fármaco y sonda de 1 ml de solución salina (0,9%) como control placebo. Tras 6 semanas de tratamiento, las ratas fueron examinadas mediante la prueba del laberinto acuático de Morris. El nivel de estradiol en el suero y en el hipocampo se midió por ELISA. Se realizó una tinción de Golgi para observar la morfología neuronal en el hipocampo. La apoptosis de las células del hipocampo se observó mediante tinción TUNEL. El contenido proteico del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 2A y 2B en la región CA1 del hipocampo se determinó mediante Western blot e inmunohistoquímica. La expresión del receptor de estrógeno (ER) y la señalización PI3K se detectaron mediante Western blot. En comparación con el grupo simulado, tanto el aprendizaje como la memoria estaban deteriorados en las ratas ovariectomizadas. Las ratas tratadas con E2 o con altas dosis de XYS mostraron un mejor aprendizaje y memoria en comparación con las ratas tratadas con solución salina. Las dosis altas de XYS redujeron significativamente la latencia de escape en el ensayo de adquisición espacial; mientras tanto, los tiempos de cruce y la duración en el cuadrante de sondeo aumentaron en el ensayo de sondeo espacial. Las altas dosis de XYS promovieron la síntesis de novo del contenido de E2 en el hipocampo, pero no tuvieron un efecto significativo sobre el nivel de E2 en suero. La tinción de Golgi indicó que la dosis alta de XYS podía aumentar el número de ramificaciones y la densidad de las espinas dendríticas en el área CA1 del hipocampo. La tinción TUNEL mostró que la dosis alta de XYS aliviaba la apoptosis neuronal inducida por la ovariectomía. El nivel de expresión de NMDAR2A y NMDAR2B en el CA1 del hipocampo se vio incrementado por el tratamiento con XYS. El efecto beneficioso de XYS fue a través de la activación de la señalización ERα-PI3K. En conclusión, el tratamiento con altas dosis de XYS puede mejorar las capacidades cognitivas de las ratas ovariectomizadas mediante la protección de las neuronas del hipocampo y la restauración del nivel de E2 del hipocampo.
1. Introducción
Las mujeres perimenopáusicas suelen sufrir ansiedad y depresión relacionadas con la fluctuación del nivel de estrógenos . Además de la ansiedad y la depresión, los olvidos son otra queja común en las mujeres perimenopáusicas. El estudio Seattle Midlife Women’s Health Study informó de que el 60% de las mujeres de mediana edad notaron un deterioro de la memoria . El Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) descubrió que la perimenopausia era un factor de riesgo dependiente de la falta de memoria declarada por las propias mujeres de mediana edad. Dado que el cerebro es un objetivo importante de la regulación de los estrógenos, se especula que la deficiencia de estrógenos puede ser responsable del deterioro cognitivo. Sin embargo, los resultados de los estudios observacionales sobre la influencia en la cognición no son totalmente consistentes . Además, aún no se han establecido intervenciones terapéuticas hormonales eficaces para mejorar el rendimiento cognitivo . Además, otros factores, como el estrés percibido, el estado de ánimo y la salud física, también pueden contribuir a los síntomas de la memoria . Es más probable que la producción de estrógenos en los ovarios afecte a la memoria en caso de disminución brusca que de transición natural . Contrariamente a la inconsistencia de los estudios en humanos, los hallazgos en animales ovariectomizados apoyan la asociación de la deficiencia de estrógenos con los cambios cognitivos y la eficacia de la terapia de reemplazo hormonal.
La suplementación con fitoestrógenos es una terapia alternativa popular para aliviar los síntomas de la menopausia. Los fitoestrógenos, como los flavonoides, las isoflavonas y los lignanos, tienen una estructura similar a la de los estrógenos esteroideos y pueden desempeñar un papel similar al de los estrógenos al activar los receptores de estrógenos (RE). Un meta-análisis apoyó la eficacia de la suplementación con isoflavonas de soja para mejorar la memoria visual en mujeres posmenopáusicas sanas . El estudio SWAN Phytoestrogen Ancillary Study demostró que la ingesta elevada de isoflavonas o ligninas podía mejorar la velocidad de procesamiento o la memoria verbal en una determinada fase de la menopausia, aunque el beneficio también estaba relacionado con la etnia/raza . El efecto de los fitoestrógenos en la mejora de la cognición está indicado de forma más evidente en estudios con animales. Un extracto hidroalcohólico de semillas de alholva podría atenuar el daño neuronal del hipocampo inducido por la ovariectomía (OVX) y mejorar el rendimiento del aprendizaje y la memoria en un modelo de rata.
Xiao-Yao-San (XYS), que significa polvo feliz y despreocupado en chino, es una fórmula de la medicina tradicional china (MTC) que se utiliza para tratar la ansiedad y la depresión menopáusicas. La fórmula está compuesta por Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe) y Glycyrrhizae radix (Gancao). Un análisis sistemático que incluía 26 ensayos aleatorios mostró que el XYS era superior a los antidepresivos, según las puntuaciones de la escala de depresión de Hamilton, y que podía aumentar la eficacia de los antidepresivos para mejorar las puntuaciones de la escala de depresión autocalificada. Las mujeres perimenopáusicas con exoftalmia y palpitaciones también podrían beneficiarse del tratamiento con XYS . Algunas acciones terapéuticas del XYS en el alivio del síndrome menopáusico pueden atribuirse a la presencia de fitoestrógenos. Varios estudios han informado de la presencia de fitoestrógenos en el XYS. El ergosterol se encuentra en Poria cocos (Fuling) , y se sabe que el β-sitosterol está presente en Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini et al. desarrollaron un ensayo de receptor estrogénico/elemento de respuesta regulado por Gal4/luciferasa para detectar la presencia de fitoestrógenos en fórmulas complejas de MTC. Analizaron la fórmula de peonía de Bupleurum &, una fórmula modificada de XYS con las mismas hierbas principales y encontraron un contenido medible de fitoestrógenos.
La presencia de fitoestrógenos en XYS sugiere que XYS tiene el potencial de tratar el deterioro cognitivo causado por la deficiencia de estrógenos. Un estudio en animales demostró que el XYS podía atenuar el déficit de aprendizaje y memoria inducido por el estrés por inmovilización crónica (CIS) . En la actualidad, ningún estudio ha evaluado el efecto de XYS en la mejora del deterioro cognitivo en mujeres perimenopáusicas. Por lo tanto, el presente estudio investigó el efecto de XYS en las capacidades cognitivas y su mecanismo subyacente en ratas OVX.
2. Materiales y Métodos
2.1. Animales y tratamiento
En total, se utilizaron 60 ratas hembra Sprague-Dawley en este estudio. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Ético Institucional de Animales de Experimentación (número de aprobación: ACU170802). Los animales se alojaron con libre acceso al agua y a la dieta estándar en condiciones de temperatura y humedad controladas. Las ratas se dividieron aleatoriamente en 5 grupos (12 ratas/grupo): grupo simulado, OVX + solución salina o grupo O-salina, OVX + 17-β estradiol (E2) o grupo O-E2, OVX + XYS 9 g/kg o grupo O-XYS9, y OVX + XYS 3 g/kg o grupo O-XYS3. Las ratas se sometieron a la operación de OVX bajo anestesia como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se realizó una incisión longitudinal en un tercio del tronco y a 1-2 cm de cada lado de la columna vertebral. Se extrajo suavemente el tejido adiposo con unas pinzas. Se identificó el ovario y se ligaron los cuernos uterinos. Se extrajo el ovario y se suturó la incisión abdominal. En el grupo simulado, se realizó una incisión abdominal sin OVX.
El tratamiento se inició dos semanas después de la operación de OVX y duró seis semanas. Las ratas de los grupos de tratamiento con XYS recibieron XYS por sonda a una dosis única diaria de 9 g/kg o 3 g/kg. La inyección subcutánea de E2 (2 μg/kg) se estableció como control farmacológico positivo. La administración de 1 ml de solución salina (0,9%) se estableció como control de placebo. Se utilizó la decocción de XYS en forma de extracto (1 g/ml, equivalente a 1 g de hierbas crudas/ml), que fue proporcionada por el Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Nanjing. La fórmula de la decocción de XYS se comunicó de forma preciosa. La dosis de XYS utilizada en la clínica para mujeres perimenopáusicas es de 175 g de hierbas crudas/60 kg, lo que equivale a 3,5 g/kg en ratas. Refiriéndonos a otros informes experimentales sobre el modelo de rata, fijamos la dosis baja en 3 g/kg y la dosis alta en 9 g/kg . Se disolvió el polvo de E2 (n.º de cat. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en una pequeña cantidad de etanol, y luego se preparó una solución madre de 20 μg/ml con solución salina al 0,9%.
2.2. Prueba del laberinto acuático de Morris
La función de aprendizaje y memoria de las ratas se evaluó mediante la prueba del laberinto acuático de Morris (MWM) . El dispositivo del experimento MWM es una piscina redonda (200 cm de diámetro) con agua de 38-40 cm de altura. La temperatura del agua se mantiene constante a 20-22°C. La prueba del MWM consta de tres partes, a saber, el ensayo de adquisición espacial (que dura 5 días), el ensayo de sondeo espacial y el ensayo de plataforma visible. En el ensayo de adquisición espacial, las ratas fueron colocadas suavemente en un cuadrante aleatorio del tanque de agua con la plataforma oculta 1,5 cm en el cuadrante noreste por debajo del agua. Se permitió a cada rata nadar hasta 60 s para encontrar la plataforma. Las ratas que no encontraban la plataforma en 60 s eran guiadas hasta ella y la latencia se registraba como 60 s. La latencia de escape se registraba mediante un sistema de análisis de vídeo (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). Las ratas fueron entrenadas 4 veces al día. Tras 5 días de entrenamiento, las ratas recibieron el ensayo de sondeo espacial con la plataforma retirada del cuadrante noreste. Las ratas fueron colocadas en el mismo lugar de inicio en el cuadrante noroeste. Se registraron los recorridos de las ratas en busca de la plataforma en 120 s. Se calculó la duración y los tiempos de cruce en el cuadrante objetivo para evaluar la retención de la memoria espacial. Al día siguiente del ensayo de sondeo espacial, las ratas recibieron el ensayo de plataforma visible, similar al entrenamiento de plataforma oculta, en el que la plataforma se elevó 1,5 cm por encima de la superficie del agua y se colocó en el cuadrante suroeste. Cada rata fue liberada 4 veces, y cada vez desde un punto de entrada diferente. Se registraron la latencia de escape, la distancia de nado y la velocidad de nado.
2.3. Recogida de muestras
Tras finalizar la prueba de MWM, las ratas fueron toracotomizadas e intubadas en la aorta ascendente a través del ventrículo izquierdo bajo anestesia con pentobarbital sódico (40 mg/kg por inyección intraperitoneal). Se recogió sangre del tronco mediante un tubo separador de suero para la detección de E2. Los hipocampos de seis ratas se separaron de la corteza cerebral y de los tejidos cerebrales circundantes, se extrajeron rápidamente, se lavaron con PBS frío y se congelaron en nitrógeno líquido para la detección de E2 y Western blot. Tres tejidos cerebrales no perfundidos se inmovilizaron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas y se utilizaron para la tinción de Golgi y la inmunohistoquímica. Las tres ratas restantes fueron perfundidas transcardialmente con solución salina fría, seguida de una fijación en paraformaldehído al 4% durante 1 h. A continuación se extrajeron los cerebros, se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 h y se incrustaron en parafina para la tinción de TUNEL.
2.4. Las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 15 minutos a 4°C para separar el suero. Los tejidos del hipocampo se pesaron, se homogeneizaron en solución salina fría y se centrifugaron durante 20 minutos para recoger el sobrenadante. El contenido de E2 en el suero y en el sobrenadante del homogeneizado del hipocampo se detectó mediante un kit ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). Tinción de Golgi
El hipocampo se cortó en pequeños bloques y se procesó para la tinción de Golgi como se describe . Brevemente, los bloques de hipocampo se sumergieron en una solución de tinción de Golgi (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shangai, China) durante 14 días, durante los cuales la solución de colorante se reemplazó cada 2-3 días. Los tejidos se deshidrataron con sacarosa al 30% y se seccionaron a 100 μm. Las secciones se procesaron con deshidratación de etanol, se aclararon con xileno y se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina. La tinción de Golgi se realizó con éxito en todas las muestras. La morfología de las neuronas del hipocampo se observó con un microscopio de luz (Nikon, Tokio, Japón). Las neuronas de la región CA1 del hipocampo se analizaron utilizando el plugin Neuron J del software Image J. Se seleccionaron cinco secciones para cada rata y se seleccionaron espinas dendríticas con morfología completa para cada sección. Se midieron la densidad y los puntos de ramificación de las espinas dendríticas.
2.6. Inmunohistoquímica
La expresión de las subunidades 2A y 2B del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) en el hipocampo se determinó mediante inmunohistoquímica según el procedimiento estándar . Los anticuerpos primarios utilizados fueron conejo anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, China) y conejo anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China). El anticuerpo secundario fue IgG de conejo conjugado con HRP (Servicebio).
2.7. Tinción TUNEL
Los cambios morfológicos en el hipocampo se detectaron mediante la tinción TUNEL con un kit comercial (Roche, Mannheim, Alemania) según las instrucciones. Las secciones se sometieron a una reacción colorimétrica DAB seguida de una tinción con hematoxilina. El núcleo de las células apoptóticas positivas a TUNEL era de color marrón bajo el microscopio de luz. Se seleccionaron cinco secciones para cada rata y se seleccionaron tres campos no repetitivos (aumento de 400x) para cada sección. Se calculó el porcentaje de células TUNEL-positivas en todas las células.
2,8. Western Blot
Se extrajo rápidamente la parte cerebral del hipocampo CA1 y se cortó en pequeñas secciones según el Atlas cerebral. Los tejidos del hipocampo se incubaron durante la noche con tampón de lisis RIPA (que contenía 100 Mm de PMSF, adquirido en Servicebio). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación durante 10 minutos para recoger el sobrenadante que contenía proteínas. La concentración de proteínas se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Los lisados de proteínas (30 μg/carril) se separaron mediante SDS-PAGE al 10% y se electroblottearon en una membrana de PVDF. Tras ser bloqueada con leche descremada al 5%, la membrana se sondeó durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), conejo anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), conejo anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), conejo anti-ERα (1 : 2000, Millipore), conejo anti-fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), conejo anti-fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), conejo anti-Bax (1 : 1000, Abcam), conejo anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam), y conejo anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). Se detectó GAPDH como control interno. A continuación, la membrana se sondeó con un IgG de cabra anti-conejo secundario conjugado con peroxidasa (HRP) (1 : 5000, Bioworld) durante 1,5 h. Las bandas se visualizaron por el método de quimioluminiscencia. La densidad óptica media de las bandas de proteínas se cuantificó con el software Image J.
2.9. Análisis estadístico
Los datos experimentales se analizaron mediante el software GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA). Los datos numéricos se expresaron como media ± SD. La diferencia entre dos grupos se comparó mediante la prueba t. Los resultados de la prueba de la plataforma oculta se analizaron mediante un ANOVA de medidas repetidas por grupo × día, seguido del post hoc de Tukey. Otras comparaciones múltiples se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido del post hoc de Tukey. El valor < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
3.1. La decocción de Xiao-Yao-San mejora las capacidades de aprendizaje espacial y de memoria de las ratas ovariectomizadas
La capacidad de aprendizaje se evaluó primero mediante el ensayo de adquisición espacial. El ANOVA de medidas repetidas mostró que tanto el tratamiento como los días de entrenamiento afectaban a la latencia de escape (Figura 1(a)). La latencia de escape en todos los grupos disminuyó con el aumento de los días de entrenamiento (), y la diferencia también fue significativa en la tendencia de disminución de la latencia dentro de cada grupo (). No hubo interacción entre el tratamiento y los días de entrenamiento (). Durante los dos primeros días de entrenamiento, no se observaron diferencias significativas en la latencia de escape de cada grupo. A partir del tercer día de entrenamiento, la latencia de escape fue significativamente más larga que la del grupo simulado; la latencia de escape del grupo de E2 y altas dosis de XYS9 fue más corta que la del grupo de solución salina, pero no fue diferente de la del grupo simulado. Después de 5 días de entrenamiento, se evaluó a las ratas con la prueba de la sonda para comprobar la memoria espacial. Como se muestra en la Figura 1(b), los tiempos de cruce, el tiempo de duración y el porcentaje de tiempo de duración en el cuadrante de sondeo se redujeron significativamente en el grupo salino. No se observaron diferencias en el tiempo de duración en otros cuadrantes. El tratamiento con XYS o E2 pudo restaurar significativamente los tiempos de cruce y el tiempo de duración en el cuadrante de la sonda al nivel del grupo simulado. Para excluir los efectos de los factores ambientales y de los niveles cognitivos y de actividad de los animales experimentales sobre el aprendizaje y la memoria espaciales, las ratas se sometieron también al ensayo de la plataforma visible (Figura 1(c)). No hubo diferencias significativas en la latencia de escape, la distancia de nado y la velocidad de nado entre los grupos. En conjunto, estos resultados sugieren que el aprendizaje y la memoria espaciales estaban deteriorados en las ratas OVX, y el tratamiento con altas dosis de XYS podría mejorar eficazmente las funciones cognitivas deterioradas.
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3.2. La decocción de Xiao-Yao-San aumenta el contenido de estrógeno del hipocampo en ratas ovariectomizadas
A continuación, estudiamos el efecto del XYS sobre el nivel de estrógeno en ratas OVX. Como se muestra en la figura 2(a), el tratamiento con XYS no mejoró el nivel de estradiol sérico reducido debido a la OVX; sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de estradiol sérico entre los grupos de tratamiento simulado y de OVX. Cabe destacar que las dosis altas de XYS y E2 aumentaron el nivel de estradiol en el hipocampo en comparación con la solución salina (Figura 2(b)). El grupo O-XYS3 seguía teniendo niveles de estradiol en el hipocampo más bajos que el grupo simulado. El cambio del contenido de E2 en el hipocampo puede no explicarse por el cambio del contenido de E2 derivado de las gónadas, sino por el cambio de la síntesis in situ. Por lo tanto, detectamos la expresión de CYP19, la enzima final en la síntesis de estrógeno, en el hipocampo. Los resultados mostraron que el tratamiento con XYS o E2 podía aumentar la expresión de CYP19 en comparación con el grupo salino (), pero sólo la diferencia entre los grupos de dosis altas de XYS y salino fue significativa (). El tratamiento no restableció el nivel de CYP19 al del grupo simulado. Los resultados sugieren que XYS promovió la expresión de la aromatasa en el hipocampo, aumentando así la síntesis de novo de E2.
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3.3. La decocción de Xiao-Yao-San reduce el daño neuronal en el hipocampo de ratas ovariectomizadas
La morfología celular en el hipocampo, especialmente en la región CA1, desempeña un papel importante en la capacidad cognitiva . La morfología celular en el hipocampo se analizó mediante tinción de Golgi, como se muestra en la Figura 3(a). En comparación con el grupo simulado, el número de neuronas en el grupo de la solución salina disminuyó significativamente, y la morfología de las espinas dendríticas estaba dañada. Otros análisis de las neuronas CA1 mostraron que el número puntual de neuronas y la densidad de las espinas dendríticas disminuyeron significativamente en el grupo salino (Figuras 3(b) y 3(c)). El tratamiento con altas dosis de XYS aumentó el número de neuronas en el hipocampo y elevó el número puntual de neuronas y la densidad de espinas en la región CA1. El tratamiento con E2 tuvo el mismo efecto terapéutico que la dosis alta de XYS. Sin embargo, la dosis baja de XYS no mejoró eficazmente el daño neuronal en la región CA1 del hipocampo. En consecuencia, la apoptosis de las neuronas del hipocampo (CA1, CA3, DG) se redujo con el tratamiento con dosis altas de XYS o E2 (Figura 4). Sin embargo, la dosis baja de XYS sólo pudo reducir la apoptosis de las neuronas CA3, pero no tuvo ningún efecto sobre las neuronas CA1 y DG. En conjunto, la dosis alta de XYS podría reducir el daño neuronal en el hipocampo, especialmente en la región CA1.
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La decocción de Xiao-Yao-San aumenta la expresión en el hipocampo de NMDAR2A y NMDAR2B en ratas ovariectomizadas.
La plasticidad sináptica es la base neurobiológica del aprendizaje y la memoria a largo plazo, y el rendimiento en la prueba MWM está influenciado por la función NMDAR . Por lo tanto, estimamos además la expresión de las subunidades 2A y 2B de NMDAR en el CA1 del hipocampo. El Western blot (Figuras 5(a) y 5(b)) mostró que la expresión de NMDAR2A y NMDAR2B estaba reducida en las ratas OVX. El tratamiento con XYS o E2 aumentó significativamente el nivel de expresión de estas dos proteínas hasta el mismo nivel que en el grupo simulado. La inmunohistoquímica (Figura 5(c)) también mostró que la proporción de células teñidas positivas aumentó en los grupos de tratamiento. En comparación con el grupo salino, la dosis alta de XYS aumentó significativamente la expresión tanto de NMDAR2A como de NDMAR2B ( y 0,013, respectivamente), pero la dosis baja de XYS sólo pudo aumentar significativamente la expresión de NMDAR2A ().
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3.4. La decocción de Xiao-Yao-San activa la vía de señalización de PI3K a través del ERα
El impacto del E2 o de los fitoestrógenos en la fisiología está mediado por la señalización del ER. Los estudios han demostrado que la activación de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), una proteína quinasa activada por mitógenos, es necesaria para los efectos beneficiosos de E2 en la memoria . La fosforilación de ERK1/2 depende de la activación de PI3K . Por lo tanto, investigamos el efecto de XYS en la señalización ER-PI3K. Como se muestra en la figura 6, las dosis altas de XYS y E2 promovieron significativamente la expresión de ERα, ERα fosforilado (Ser118) y PI3K p110β (la subunidad catalítica) en comparación con el grupo salino. La activación de ERα-PI3K redujo aún más la expresión del factor proapoptótico Bax y aumentó la expresión del factor antiapoptótico Bcl-2. Sin embargo, la dosis baja de XYS no influyó significativamente en la señalización del ERα-PI3K, lo que coincide con los resultados de las figuras 3 y 4.
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4. Discusión
El XYS se ha utilizado durante mucho tiempo para tratar la ansiedad y la depresión perimenopáusicas. Nuestro estudio exploró la nueva aplicación de XYS en el tratamiento del deterioro cognitivo inducido por OVX. Los resultados mostraron que XYS mejoró eficazmente el aprendizaje espacial y la memoria espacial en ratas OVX. El posible mecanismo es que XYS promueve la síntesis de novo de estrógeno en el hipocampo, activando así la vía de señalización ERα-PI3K e inhibiendo la apoptosis de las neuronas del hipocampo.
El mecanismo subyacente de XYS para el tratamiento de la depresión ha sido ampliamente estudiado. El XYS desempeña un papel antidepresivo mediante la regulación de una amplia red en la que participan neurotransmisores, neurotrofinas, el eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal, aminoácidos y lípidos. Algunos de estos estudios han demostrado que el XYS puede actuar sobre los cambios cerebrales relacionados con el estrés. Los ensayos in vitro mostraron que un suero que contenía XYS podía revertir el cambio en el potencial de la membrana mitocondrial, la concentración de calcio libre y la tasa de apoptosis de las neuronas inducida por el estrés oxidativo . Nuestro estudio demostró que el XYS también atenuaba la apoptosis neuronal en la región del hipocampo de las ratas OVX. Los efectos antiapoptóticos de XYS sugieren que tiene el potencial de actuar en una variedad de procesos patológicos relacionados con la apoptosis neuronal del cerebro.
Los resultados de nuestro estudio mostraron que XYS podía restaurar el nivel de estrógeno en el hipocampo de las ratas OVX. El hipocampo es esencial para la formación de la memoria y es rico en RE, y el estrógeno facilita una mayor salud cognitiva y sináptica a través de estos RE . Varios ensayos clínicos indicaron la eficacia de la terapia de sustitución hormonal en los síntomas cognitivos relacionados con la pérdida de estrógenos en las mujeres . El XYS pudo aumentar el nivel de estradiol en el hipocampo, lo que debería ser la base crucial de su eficacia para mejorar las capacidades cognitivas de las ratas OVX. Sin embargo, el XYS no aumentó el nivel de estradiol en suero. Esto puede deberse a que el estradiol puede sintetizarse de novo en el hipocampo, mientras que el estradiol sérico se origina en las gónadas. Nuestros resultados mostraron que el XYS aumentó la expresión del CYP19 en el hipocampo, sugiriendo que el aumento de E2 en el cerebro era probablemente derivado del hipocampo. Los resultados de nuestro estudio mostraron que el XYS aumentó la expresión de NMDAR2A y NMDAR2B en el hipocampo de las ratas OVX. Este hallazgo es coherente con estudios anteriores. Se descubrió que el estrógeno aumentaba tanto la densidad de espinas dendríticas como el número de sinapsis en el hipocampo a través de la modulación de las funciones NMDAR en ratas OVX. El estrógeno también podría restaurar la morfología de las neuronas del hipocampo en ratas envejecidas, restaurando el nivel de NMDAR2B al observado en el nivel joven en la región CA1; es más, el estrógeno podría afectar a la movilidad de NMDAR2A y NMDAR2B a través de la sinapsis . La activación de NMDAR, a su vez, podría contribuir a la síntesis de E2 en el hipocampo al inducir la afluencia de Ca2+.
Además de los NMDARs, el XYS puede regular la expresión de otros factores relacionados con la cognición en el cerebro. La pérdida de la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95), la sinaptofisina y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en el hipocampo se ha correlacionado directamente con los déficits de aprendizaje y memoria. El efecto del XYS en ratas con SCA se ha relacionado con la promoción de la expresión de PSD-95 y sinaptofisina en el hipocampo. También se ha demostrado que el XYS regula el BDNF en el córtex frontal, la región CA1 del hipocampo y la amígdala de las ratas con SCA. Durante el proceso de tratamiento del SIA con XYS, la vía de señalización de la c-Jun N-terminal kinase (JNK) se inhibió en el hipocampo.
Aunque no hemos explorado específicamente qué componente es el principal activo del XYS sobre el aprendizaje y la memoria, nuestros resultados sugieren que la principal fuente de fitoestrógenos en el XYS es un candidato digno de mayor investigación. La investigación de los antidepresivos también puede proporcionarnos algunas pistas. Jiali Liu et al. descubrieron que el Bupleuri radix (Chaihu) es el principal fármaco antidepresivo en la prescripción del XYS, basándose en el análisis farmacoquímico del suero de la fracción de éter de petróleo. Un estudio in vitro demostró que el extracto de Bupleuri radix promovía la proliferación de células de neuroblastoma a través de la activación de la vía PI3K/AKt. La activación de PI3K también se observó en nuestro estudio. Los informes clínicos actuales muestran que el XYS tiene un importante efecto terapéutico antidepresivo, pero no hay ningún estudio toxicológico claro sobre la toxicidad y los efectos secundarios del XYS en detalle. En general, el XYS puede considerarse como una prescripción sin demasiados efectos secundarios. El XYS tiene varias recetas modificadas, cuyos ingredientes básicos son los mismos que el XYS. Un reciente metaanálisis ha evaluado la eficacia y la seguridad del XYS modificado en el tratamiento del síndrome perimenopáusico. Los resultados agrupados sugieren que el XYS modificado podría ser más eficaz y seguro para el tratamiento del síndrome perimenopáusico en comparación con la terapia hormonal sustitutiva . Sin embargo, debido a la escasa metodología de los estudios incluidos, la eficacia y la seguridad del XYS necesitan ensayos más rigurosos para su confirmación. Utilizando el método de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H, el grupo de investigación de Xiaoxia Gao informó de que la fracción de éter de petróleo que contiene componentes lipofílicos era la más eficaz para tratar la depresión . También informaron de que el Radix Bupleuri, el principal componente antidepresivo, podía producir más efectos tóxicos en el hígado o el riñón de ratas sanas que en ratas con estrés crónico leve imprevisible. Los efectos tóxicos se asociaron con el aumento de la concentración de ácidos biliares, la facilitación de la degradación de la lisina y la alteración metabólica de los esfingolípidos, los glicerofosfolípidos y los ácidos grasos . Este resultado fue corroborado en un reciente estudio metabolómico de pacientes con depresión. El XYS desempeñó un papel antidepresivo al regular la síntesis de leucina, valina e isoleucina y el metabolismo del ácido binario, el ácido graso, la argina y la prolina . Estos estudios sugieren que es necesario vigilar estrechamente el estado del paciente con un ajuste oportuno de la dosis del fármaco para prevenir los efectos secundarios tóxicos.
5. Conclusiones
En este estudio, demostramos que el tratamiento con altas dosis de XYS tuvo una eficacia similar a la del E2 en la mejora de las capacidades cognitivas de las ratas OVX. El efecto terapéutico fue mediado por la protección de las neuronas del hipocampo y la restauración del nivel de E2 en el hipocampo. La vía de señalización ERα-PI3K estuvo implicada en el proceso. Nuestro estudio sugiere que el XYS podría ser una opción para el tratamiento del deterioro cognitivo perimenopáusico. En la actualidad, el XYS se utiliza principalmente en el tratamiento de la ansiedad y la depresión clínicas. Se necesitan más datos clínicos para verificar su efecto en la mejora de la función cognitiva.
Disponibilidad de los datos
Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener ningún tipo de conflicto de intereses.
Contribuciones de los autores
Lina Liu y Fei Ge han contribuido a partes iguales a esta investigación.
Agradecimientos
Esta investigación ha contado con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795 y 81903974); la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (Subvención núm. BK20181235); la Oficina Provincial de Medicina Tradicional China de Jiangsu (Subvención núm. YB2017066); el Proyecto del Plan de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de Nanjing (Subvención núm. 201715072); el Proyecto del Hospital de Medicina China de la Provincia de Jiangsu (Subvención n.º Y2018CX09); y un Proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.