La enfermedad de Albers-Schönberg (osteopetrosis autosómica dominante, tipo II) resulta de mutaciones en el gen del canal de cloruro ClCN7

Abstract

La enfermedad de Albers-Schönberg, u osteopetrosis autosómica dominante, tipo II (ADO II), es la forma más común de osteopetrosis, un grupo de afecciones caracterizadas por un aumento de la masa esquelética debido a la alteración de la resorción de hueso y cartílago. Tras la asignación del gen causante de la ADO II al cromosoma 16p13.3, ahora informamos de siete mutaciones diferentes en el gen que codifica el canal de cloruro ClCN7 en las 12 familias de ADO II analizadas. Además, se identificó un paciente con la forma infantil autosómica recesiva grave de osteopetrosis (ARO) que era homocigoto para una mutación ClCN7. A partir de las correlaciones genotipo-fenotipo, parece que la ADO II refleja un efecto negativo dominante, mientras que las mutaciones de pérdida de función en ClCN7 no causan anomalías en los individuos heterocigotos. Dado que algunos pacientes con ARO tienen mutaciones en ambas copias del gen ClCN7, el ADO II es alélico con un subconjunto de casos de ARO.

Recibido el 2 de octubre de 2001; revisado y aceptado el 11 de octubre de 2001.

INTRODUCCIÓN

En la salud, la remodelación del tejido óseo resulta de los procesos equilibrados de formación y resorción ósea. Una resorción excesiva provoca osteoporosis, que es la causa de la mayoría de las fracturas no traumáticas (1). Por el contrario, una reabsorción ósea defectuosa provoca una osteopetrosis caracterizada por huesos densos pero generalmente frágiles. Se han descrito al menos ocho tipos de osteopetrosis en humanos (2). La deficiencia de la isoenzima de la anhidrasa carbónica II causa osteopetrosis autosómica recesiva (ARO) con acidosis tubular renal y calcificaciones cerebrales (3; MIM 259730), mientras que la mayoría de los casos de ARO maligna (4; MIM 259700) reflejan mutaciones en el gen TCIRG1 (5,6). Algunos casos raros de osteopetrosis, aparentemente con un modo de herencia autosómico recesivo, presentan un fenotipo más leve, por lo que se denominan forma «intermedia» (7,8; MIM 259710).

La osteopetrosis autosómica dominante (ADO) es mucho más común que sus homólogas recesivas (9). Sin embargo, debido a su cuadro clínico relativamente benigno, ya que muchos pacientes son asintomáticos y sólo se detectan mediante un examen radiográfico casual, la prevalencia de la ADO está subestimada. Entre las familias con ADO, se suele informar de dos subtipos basados principalmente en las características radiográficas (10,11). El tipo I (ADOI) presenta una osteoesclerosis generalizada y difusa que afecta especialmente a la bóveda craneal (11). El tipo II (ADO II; MIM 166600), la forma descrita originalmente en 1904 por Albers-Schönberg (12), es la forma más común con una prevalencia estimada de hasta 5,5/100 000 (13). Las manifestaciones clínicas incluyen fracturas no traumáticas, especialmente de huesos largos, parálisis de los nervios craneales, osteoartritis de la cadera y osteomielitis mandibular (14). La ADO II se manifiesta radiográficamente con una osteoesclerosis segmentaria, predominantemente en las placas terminales vertebrales («columna de jersey de rugby»), las alas ilíacas (signo del «hueso dentro del hueso») y la base del cráneo (9) (Fig. 1).

Recientemente, una búsqueda en todo el genoma nos llevó a asignar un gen subyacente a la ADO II al cromosoma 16p13.3 (15). Curiosamente, el gen que codifica el canal de cloruro ClCN7 reside dentro de la región candidata de 8,4 cM (16). De hecho, el canal de cloruro es esencial para la acidificación de la laguna de reabsorción extracelular necesaria para la degradación del tejido óseo mediada por los osteoclastos (17), y está mutado en un paciente con ARO (17). Por lo tanto, consideramos que ClCN7 es un gen candidato tanto posicional como funcional para causar la enfermedad de Albers-Schönberg.

RESULTADOS

Análisis de mutaciones en familias con ADO II

Debido a que la secuencia genómica que incluye el gen ClCN7 está disponible en las bases de datos de secuencias (GenBank accession nos AL031600 y AL031705), el análisis de mutaciones de los exones y de los límites entre intrones y exones es posible utilizando ADN genómico. Este esfuerzo reveló siete mutaciones distintivas en ClCN7 (Fig. 2) en 12 familias ADO II no relacionadas (Tabla 1). Cinco mutaciones son de sentido erróneo, una da lugar a la supresión de un aminoácido y otra suprime dos nucleótidos causando un cambio de marco que afecta al extremo C-terminal de la proteína. Ninguna de estas mutaciones se encontró en 100 cromosomas de control.

Cuatro mutaciones son mutaciones redundantes. La mutación 2423delAG se identificó en una familia de Francia y en una familia estadounidense. La mutación G215R se produjo en una familia francesa, una danesa y una estadounidense. La mutación P249L se encontró en una familia francesa y en una alemana. Por último, la mutación R767W se identificó en una familia francesa y otra estadounidense (Tabla 1). Los diferentes orígenes geográficos de las familias estudiadas, así como el análisis de los marcadores de microsatélite que flanquean el gen ClCN7 (datos no mostrados), indican que se trata de mutaciones independientes, es decir, no heredadas de un ancestro común.

Análisis de mutaciones de un paciente con ARO

El análisis de enlace con marcadores del cromosoma 16p13.3 mostró claramente homocigosidad para todos los marcadores en un paciente con ARO nacido de padres consanguíneos y sanos (datos no mostrados). Por lo tanto, se realizó un análisis de la mutación de ClCN7 que demostró una mutación homocigótica sin sentido en la posición 766 (L766P) (Fig. 2). Ambos progenitores son heterocigotos para esta mutación.

Posición y conservación de los aminoácidos mutados

La topología transmembrana propuesta para los canales de cloruro ClC sugiere 10-12 dominios transmembrana (18). Los cinco aminoácidos implicados en las mutaciones missense ADO II, así como la mutación implicada en el paciente de ARO, están muy conservados entre los diferentes miembros de la familia de genes de los canales de cloruro ClC (Fig. 3). Las mutaciones G215R y P249L son mutaciones recurrentes encontradas en los pacientes de tres y dos familias no relacionadas, respectivamente (Tabla 1). G215 es un residuo altamente conservado situado entre D2 y D3 (Fig. 4), una región que se sabe que influye en las propiedades del poro del canal (19), mientras que P249 participa en un elemento estructural altamente conservado que forma una parte sustancial del poro del canal ClC (20). R286 se encuentra en el espacio extracelular, justo fuera del dominio transmembrana D5. Este aminoácido se conserva entre las diferentes proteínas ClC, con la excepción de ClC1 y ClC2 que tienen una secuencia divergente en esta región de la proteína. Las dos mutaciones restantes de ADO II y la mutación ARO se encuentran en la parte citosólica y C-terminal de la proteína y afectan a aminoácidos vecinos. G765, L766 y R767 se localizan dentro del tramo D13, que coincide con el segundo dominio CBS (cistationina-β-sintasa) descrito en la proteína CLCN7 (21). Las tres mutaciones se localizan dentro del tramo β2 del dominio CBS en el que se ha informado que las mutaciones causan enfermedades humanas (22). La función precisa de este dominio aún no está clara, pero se ha sugerido un papel en la clasificación de proteínas (21).

Finalmente, las dos pequeñas deleciones implican aminoácidos de la parte C-terminal intracelular de ClCN7. El aminoácido L688, eliminado en un paciente, está situado entre los dos dominios CBS, mientras que la eliminación de dos nucleótidos a partir de la posición nucleotídica 2423 da lugar, en dos familias no relacionadas, a una proteína que difiere de la ClCN7 de tipo salvaje sólo en los últimos 10 aminoácidos.

DISCUSIÓN

Las osteopetrosis en mamíferos comprenden un grupo heterogéneo de condiciones que incluyen al menos ocho entidades clínicas diferentes en humanos (2) y unos nueve mutantes animales espontáneos (23). Además, los modelos de ratón knockout para varios genes causan fenotipos osteopetróticos, lo que ilustra la diversidad de factores que intervienen en la diferenciación y activación de los osteoclastos (23).

Recientemente, la heterogeneidad de las osteopetrosis humanas fue subrayada por la heterogeneidad genética incluso dentro del subtipo ADO II (24,25). Esta revelación se basó en un estudio de vinculación de una extensa familia danesa, que asignó el gen ADO II al cromosoma 1p21 (26). Sin embargo, esta asignación no se confirmó en estudios de otras familias de ADO II. De hecho, en nuestro reciente estudio de vinculación, que incluía seis familias con ADO II, localizamos el gen causante de la enfermedad en el cromosoma 16p13.3 y encontramos en la misma familia danesa cosegregación entre ADO II y un haplotipo del cromosoma 16p13.3 (15). Por lo tanto, especulamos que la evidencia de vinculación al cromosoma 1p21 en esta familia reflejaba una cosegregación incidental. En el presente estudio, confirmamos esta hipótesis al identificar una mutación causante de la enfermedad (G215R) en el gen ClCN7 en esta familia danesa. Esto, y el hecho de que las mutaciones en este gen se encontraron en todas las 12 familias de ADO II analizadas, sugiere que la ADO II es genéticamente homogénea.

Nuestros resultados también ilustran que la ADO II es alélica con un subgrupo de pacientes con la forma infantil grave, autosómica recesiva, de osteopetrosis. Anteriormente, se había descrito un paciente con ARO como heterocigoto compuesto para una mutación sin sentido (Q555X) y una mutación sin sentido (R762Q) en el gen ClCN7 (17). Ahora encontramos una mutación homocigota (L766P) en otro paciente con ARO.

La figura 5 ilustra nuestra correlación entre los diferentes genotipos y fenotipos. Como demuestra el fenotipo del ratón knockout de ClC-7, la pérdida completa de la función del canal de cloruro ClC-7 provoca una osteopetrosis grave como la que se observa en los pacientes con ARO. Dado que las mutaciones de ClCN7 sólo se han caracterizado en dos pacientes con ARO hasta la fecha, es imposible saber si las diferencias fenotípicas reflejan la naturaleza de sus mutaciones. Algunos casos raros de osteopetrosis presentan una forma «intermedia». En estos casos, se propone un modo de herencia autosómico recesivo, pero el fenotipo es más leve que en la ARO (7,8). Tal vez estos casos se deban a combinaciones de dos mutaciones en ClCN7 que sólo reducen levemente la capacidad de conductancia de Cl-.

Las mutaciones de ADO II que se describen aquí son principalmente mutaciones sin sentido que implican aminoácidos conservados (Figs. 3 y 4). Las dos mutaciones restantes son pequeñas supresiones que también conservan la anatomía principal del canal de cloruro y, por tanto, lo más probable es que den lugar a efectos comparables a los de las mutaciones sin sentido. Dado que los canales de cloruro parecen estar organizados como multímeros, probablemente dímeros (27), estas mutaciones probablemente perjudican su función debido a efectos negativos dominantes. Con tales efectos, la mayoría de los canales de cloruro no funcionarán, explicando las anormalidades fenotípicas.

En general, los padres de los pacientes con ARO son fenotípicamente normales. Suponemos que esto refleja el hecho de que la haploinsuficiencia para este gen muy probablemente no cause complicaciones clínicas o hallazgos radiográficos. Alternativamente, en algunos casos esto puede deberse a la reducida penetrancia de ADO II. Los padres del paciente con ARO presentado en este estudio no tienen ningún síntoma clínico de ADO II, pero no se dispuso de un estudio radiográfico.

La naturaleza alélica de ADO II y ARO se apoya en un informe de una familia extensa que segrega ADO II en la que un individuo manifestó ARO (28). Quizás en esta familia una mutación del gen ClCN7 con un efecto negativo dominante causa la ADO II que luego coincide con una mutación de novo, o una mutación heredada del segundo progenitor que causa la ARO. La explicación propuesta para las formas dominantes y recesivas de osteopetrosis asociadas a mutaciones de ClCN7 es paralela a las mutaciones del gen ClC-1 que causan miotonía. Las mutaciones que provocan la pérdida de ClC-1 causan la forma autosómica recesiva (tipo Becker) (29), mientras que las mutaciones sin sentido se manifiestan con la forma autosómica dominante menos grave (tipo Thomsen) (30).

En conclusión, demostramos que la mayoría, si no todos, los casos de ADO II están causados por mutaciones en el gen ClCN7. Basándonos en la naturaleza de las mutaciones de ClCN7, el fenotipo de ADO II es probablemente el resultado de un efecto negativo dominante. Nuestros hallazgos apoyan la hipótesis de que los canales de cloruro actúan generalmente como homomultímeros. Además, nuestro estudio ilustra la naturaleza alélica de ADO II y de un subconjunto de casos de ARO.

MATERIAL Y MÉTODOS

Familias y pacientes

Las familias A-F se describieron previamente ya que se utilizaron para localizar el gen de la enfermedad de Albers-Schönberg en el cromosoma 16p13.3 (15). Las muestras G-L son de individuos afectados de familias con antecedentes de la enfermedad de Albers-Schönberg y también se han descrito varias (31-33) (Tabla 1).

La familia M vive en Estados Unidos pero es de ascendencia china. La proposita es hija de una pareja sana y nació tras una gestación a término. Los padres son primos segundos. Se le diagnosticó a los 3 meses de edad cuando se presentó en el New York Hospital Medical Center de Queens con parálisis de Bell. El estudio radiográfico del esqueleto reveló una osteopetrosis grave y varias fracturas oblicuas no desplazadas. Tenía anemia, reticulocitosis, hepatoesplenomegalia y atrofia leve del nervio óptico. La niña fue sometida a un trasplante alogénico de médula no compatible, pero falleció a los 18 meses de edad por sepsis e insuficiencia respiratoria.

Análisis de mutaciones

El ADN se aisló de la sangre mediante procedimientos estándar. Los cebadores de intrones (Tabla 2), que amplifican todos los exones codificantes y los límites entre intrones y exones de ClCN7, se diseñaron a partir de secuencias genómicas (números de acceso del GenBank AL031600 y AL031705). Los 25 exones se amplificaron a partir de ADN genómico con Taq-polimerasa o con el sistema de potenciación PCR (Gibco BRL), con una concentración de potenciación 1×. Para todas las amplificaciones, se realizaron 30 ciclos a la temperatura especificada en la Tabla 2.

Los productos de la PCR se purificaron con el sistema de purificación Concert Rapid PCR (Life Technologies) y se secuenciaron directamente con los cebadores utilizados para la amplificación, utilizando la química terminadora Big-Dye (Perkin-Elmer) en un secuenciador automático ABI 3100. La amplificación del exón 9 dio lugar a un fragmento de longitud variable porque este exón sigue una repetición en tándem de una secuencia de 50 pb con un número de copias variable. En nuestro conjunto de muestras el número de copias varió entre cuatro y siete repeticiones. Esta repetición también interfiere en algunas muestras con la secuenciación de este exón en la dirección hacia adelante.

Todos los exones en los que se detectaron mutaciones putativas, se secuenciaron en 100 cromosomas de control sin encontrar las mutaciones.

ACONOCIMIENTOS

Damos las gracias a los pacientes y las familias, así como a los clínicos que proporcionaron material. Esta investigación fue apoyada por una beca (G.0404.00) del «Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek» (FWO) a W.V.H. Esta investigación también fue apoyada por becas de la «Société Française de Rhumatologie» (SFR), el «Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris» (FERCMHP) y el Shriners Hospital for Children (no. 8540).