En este estudio se planteó la hipótesis de que los diferentes métodos de aislamiento de ARN afectarán a los resultados cuando se analice la expresión génica en los tejidos. Los métodos de extracción de ARN pueden caracterizarse a grandes rasgos en extracción con fenol:cloroformo seguida de precipitación con alcohol (TRIzol), fenol:cloroformo seguida de extracción en fase sólida (en columna; miRVana y miRNeasy) y separación en fase sólida con/sin resina de afinidad (Norgen total e Isolate II). Estas metodologías se desarrollaron principalmente para la extracción de ARNm largos y se han basado en el supuesto de que todos los ARN se purifican por igual. Además, hay una serie de consideraciones para elegir un método de extracción de ARN en particular, como la calidad, la cantidad, el precio y la facilidad de uso (tiempo de extracción). Aquí presentamos datos que demuestran que el método utilizado para extraer el ARN también producirá resultados variables en comparación con los diferentes métodos en las aplicaciones posteriores y, por lo tanto, es otra consideración importante.
Este estudio demuestra que los métodos de aislamiento de ARN varían en cuanto a la cantidad y la calidad de las muestras de ARN, y en el análisis de la expresión de miARN y genes diana. Elegimos órganos que pueden ser difíciles de aislar el ARN por diferentes razones. Por ejemplo, a menudo se observa que el aislamiento de ARN del cerebro da lugar a bajos rendimientos debido a su alto contenido en lípidos. Esto fue particularmente evidente con el kit Bioline Isolate II. El protocolo del fabricante sugiere que se deben purificar hasta 5 μg de ARN a partir de 10 mg de cerebro de rata/ratón. Sin embargo, el manual de miRNeasy sugiere que deberían poder obtenerse entre 5 y 20 μg de ARN a partir de cerebro con la misma cantidad de material de entrada. La resolución de problemas en el sitio web del fabricante describe que un problema con los tejidos ricos en lípidos es la obstrucción de la columna y sugiere disminuir la cantidad de muestra o aumentar el volumen del tampón de lisis. Nuestras extracciones se realizaron dentro de los límites sugeridos por el protocolo. Posteriormente, sugieren realizar una preextracción con el reactivo TRIsure (el equivalente de Bioline al TRIzol) y luego una separación en columna con el kit para limpiar la fase acuosa. Este método sería entonces comparable a los métodos de extracción de ARN miRVana y miRNeasy y podría dar lugar a mejores rendimientos para este tejido. Además, la calidad del ARN se correlaciona con las respuestas específicas del tejido al estrés fisiológico tanto antes como después de la muerte del tejido. Los tejidos como el pulmón y el hígado tienen característicamente un RIN bajo y un pequeño pico de 28S, ya que estos tejidos son propensos a una degradación más rápida del ARN por altos niveles de nucleasas. Para inactivar las nucleasas, el tejido se congela rápidamente y se evita la descongelación hasta que el material pesado se añade al tampón de extracción. Aunque se impidió la descongelación del tejido, no podemos descartar que el tiempo transcurrido desde la eutanasia del animal y la escisión de los órganos hasta la congelación rápida sea un factor que contribuya a los bajos valores generales de RIN y a algunos productos de degradación observados en todas las muestras de pulmón, independientemente del kit de aislamiento utilizado. Un método alternativo para inactivar las nucleasas es utilizar una solución estabilizadora de ARN como RNAlater (ThermoFisher Scientific), que permite procesar posteriormente las muestras de tejido no congeladas. Puede ayudar a garantizar la integridad del ARN, pero no es compatible con todos los procedimientos de aislamiento de ARN y los usuarios deben comprobar su método específico antes de realizar las extracciones. La aparición de un pico después de 60 s en algunas muestras en el análisis del Bioanalizador sugiere una contaminación por ADNg. Se puede realizar un tratamiento adicional con DNasa en las columnas con algunos kits, sin embargo, se recomienda encarecidamente un paso de eliminación del ADNg durante la etapa de transcripción inversa. La inclusión de este paso en nuestros métodos puede explicar por qué no hubo interferencias al analizar la expresión de ARNm de las muestras de pulmón de Norgen, pero sí tuvo un impacto en el análisis de la expresión de ARNm, ya que el protocolo del ensayo Taqman de ARNm no incluye la eliminación del ADNg. Además, la pureza de las muestras de ARN es un factor crítico, ya que aunque las muestras con RIN > 7 deberían funcionar bien en la mayoría de las aplicaciones posteriores, las que implican reacciones enzimáticas como la qPCR pueden ser inhibidas por nucleasas, iones metálicos o contaminantes orgánicos. En general, las muestras de ARN de Bioline Isolate II tenían relaciones 260/230 más bajas y los contaminantes podrían estar contribuyendo a su bajo rendimiento. Por último, se observaron diferencias en el enriquecimiento para miRNAs en la preparación de ARN total. Como los miARNs representan una pequeña fracción del repertorio total de ARN, puede ser difícil determinar su contribución a partir del análisis de integridad. El ensayo de microARN Qubit ofrece una detección altamente selectiva de bajas cantidades de ARN pequeños incluso en presencia de contaminantes comunes. Comúnmente se detectaron altos porcentajes de miRNAs con los métodos de extracción miRVana y Norgen, sin embargo, dado el análisis de integridad para las preparaciones de RNA total Norgen, es posible que el enriquecimiento de miRNAs pueda estar sobreestimado ya que se están detectando fragmentos de RNAs más pequeños tras la degradación u oxidación de RNAs más grandes (mRNAs, rRNA o tRNAs) o en el caso de las muestras de pulmón la contaminación del ADN perturbando los resultados del Qubit. Por lo tanto, la cantidad, la calidad y la pureza de las muestras de ARN son factores muy importantes a la hora de elegir un método de extracción de ARN concreto y la investigación adicional sobre cómo optimizar estos métodos para su tejido de interés puede ayudar a mejorarlos.
El perfilado de miARNs puede dar una idea como biomarcadores para aplicaciones de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, los paneles de miRNAs pueden utilizarse para clasificar diferentes fenotipos de cáncer, predecir la recurrencia o la respuesta a las terapias . Sin embargo, para el descubrimiento y la aplicación clínica de los biomarcadores basados en miARN es necesario optimizar y estandarizar las prácticas de extracción del ARN para evitar resultados contradictorios. Por ejemplo, un meta-análisis de 63 estudios publicados por Zhou et al. (2014) encontró resultados inconsistentes e incluso contrastantes al evaluar el valor pronóstico del oncomiR, miR-21 . Los autores atribuyen la heterogeneidad a las diferencias en la procedencia de las muestras, los métodos de detección y los métodos de normalización, pero no aludieron a los métodos de extracción del ARN, a lo que demostramos que también contribuye.
Las funciones biológicas y las dianas de muy pocos miARN han sido validadas experimentalmente, pero esto es fundamental para aprovechar el potencial de la terapia basada en miARN. Además, el descubrimiento de las funciones biológicas específicas de cada tejido ayudará a identificar su acción terapéutica y los posibles efectos no deseados en los tejidos normales. La validación de las interacciones miARN-ARNm se realiza principalmente en ensayos de cultivo celular, que implican la manipulación artificial de los miARN endógenos. Sin embargo, los niveles alcanzados mediante la manipulación en cultivos celulares (por ejemplo, la transfección de imitadores) no suelen corresponder a los niveles fisiológicos observados in vivo, por lo que es importante recapitular los resultados en modelos animales adecuados. Actualmente, ningún informe ha comparado directamente la detección de miARN y de genes diana a partir de muestras de ARN total utilizando diferentes métodos de extracción. Demostramos que los métodos de extracción de ARN difieren en su eficacia a la hora de aislar tanto los ARN cortos como los largos y, por lo tanto, se debe considerar cuidadosamente la elección de un método adecuado si se desea detectar ambos a partir de la misma muestra.
La investigación anterior ha asumido comúnmente que todos los tipos de ARN se purifican por igual. Sin embargo, han surgido varios informes que indican diferencias en la eficiencia de la extracción dependiendo del método utilizado para el aislamiento del ARN. Kim et al. (2011) se retractaron de su artículo en Molecular Cell porque descubrieron que sus conclusiones sobre las diferencias en la expresión de miARN de las células cultivadas a diferentes confluencias (alta densidad frente a baja densidad) y cuando se desprendían de la placa de cultivo (adherente frente a suspensión) se explicaban en realidad por las diferencias en la eficiencia de extracción de ARN utilizando el método TRIzol . Descubrieron que los miARN con bajo contenido de GC y estructura secundaria estable se perdían durante la extracción, en lugar de degradarse en las células como habían publicado inicialmente . Los resultados anteriores de El-Khoury et al. (2016) encontraron diferencias en la recuperación de miRNA de células, plasma y exosomas derivados de la orina/plasma al comparar los kits de extracción de TRIzol LS, miRNeasy de suero/plasma y miRCURY de biofluidos . Los autores descubrieron que el kit miRCURY aislaba ARN de alta pureza pero recuperaba poco miARN, TRIzol producía ARN de baja pureza que afectaba a la eficacia de la PCR, mientras que miRNeasy producía ARN de baja calidad pero era el que mejor funcionaba para la detección de miARN. Asimismo, McAlexander et al. (2013) encontraron diferencias en la extracción de miARN del plasma y del líquido cefalorraquídeo. Compararon las extracciones de miRVana, miRCURY Cell and Plant kit y TRIzol LS con y sin glucógeno como portador. miRVana fue similar con o sin glucógeno, mientras que miRCURY sin glucógeno tuvo una recuperación de miRNA ligeramente inferior a la de miRVana. Sin embargo, el glucógeno mejoró mucho la recuperación de miARN con el kit miRCURY, pero agravó el bajo rendimiento y la variabilidad con la extracción de TRIzol. A continuación, compararon el kit miRCURY Cell and Plant con los métodos de extracción de miRCURY Biofluids y miRNeasy de suero/plasma con glucógeno como portador y descubrieron que miRCURY Biofluids tenía la mayor abundancia relativa de miRNA exógeno introducido y concluyeron que era el método superior para su aplicación particular. En conjunto, estos estudios ponen de manifiesto las diferencias en la recuperación de ARN utilizando diferentes métodos de extracción y sugieren la necesidad de optimizar para su célula, tejido y/o fluido de interés.
Hay varios pasos durante el flujo de trabajo que pueden introducir variaciones experimentales. Empezando por el método de fijación o congelación del tejido, el almacenamiento del material, el método de extracción del ARN, el método utilizado para la transcripción inversa y la amplificación de la qPCR u otras plataformas posteriores. En este estudio hemos intentado controlar algunas de estas variables mediante la congelación rápida de los tejidos, el almacenamiento a – 80 °C, la prevención de la descongelación antes de la extracción y el uso de las prácticas más recomendadas para el análisis de la expresión de miARN. Por ejemplo, se ha demostrado que el uso de cebadores RT específicos de la secuencia en lugar de un cebador RT universal es superior para la amplificación de productos específicos . La qPCR se considera el estándar de oro para el análisis de la expresión de miARN y de la diana debido a su sensibilidad y especificidad sobre las plataformas de perfiles globales. Es importante destacar que la calidad de los resultados obtenidos es más importante que el mero número de miRNAs perfilados a partir de grandes plataformas basadas en la secuenciación. Además, aunque no comparamos el efecto del enriquecimiento de miARN de nuestras muestras de ARN, informes anteriores lo han desaconsejado, especialmente para las plataformas de perfilado global de miARN. Por ejemplo, Redshaw et al. (2013) descubrieron que el procedimiento de enriquecimiento de ARN corto da lugar a niveles de miARN significativamente menores cuando se comparan el ARN total y el material enriquecido, concretamente el procedimiento de enriquecimiento redujo el número de copias de miARN hasta un 25% del presente en las muestras preenriquecidas y que esta pérdida varió para diferentes secuencias de miARN. Por lo tanto, los datos de miARN procedentes de preparaciones de ARN total y corto pueden no ser directamente comparables. Además, se ha sugerido que los ARN más grandes pueden actuar como portadores de los ARN pequeños . Queda por determinar si los métodos de enriquecimiento de miARN para todas las empresas darían lugar a una mejor recuperación de los tejidos. Aunque Bioline sugiere un kit separado para el aislamiento de miARN, utilizamos el kit de ARN total Isolate II para compararlo directamente con otros métodos de extracción, ya que el kit específico de miARN no permite el aislamiento de ARN cortos y largos a partir de la misma elución. Más bien, las especies de miARN se enriquecen y se aíslan primero, y luego se pueden extraer los ARN largos, dando lugar a dos fracciones separadas. Aunque el Isolate II no está optimizado para aislar ARN pequeños como los kits miRVana o miRNeasy, tampoco era superior para la expresión del gen objetivo. Dada la gran discrepancia entre ciertos kits, los investigadores deberían optar por un método de extracción más robusto.