Químicos y reactivos
GT se adquirió en el mercado de Taichung, Taiwán. El IS (pureza del 97%) se obtuvo de Alfa Aesar (Lancaster, Reino Unido). La 6,7-dimetoxicumarina (6,7-DMC, pureza del 98%) fue suministrada por Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, EE.UU.). La CE (pureza del 90%), el ECG (pureza del 98%), el EGCG (pureza del 95%), el ácido fórmico, el probenecid, el ácido fosfórico (glacial, 85%) y el metil-parabeno se adquirieron en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.). El EGC (pureza del 92,7%) se obtuvo de ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, EE.UU.). y el acetato de etilo eran de grado LC y se obtuvieron de ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwán). El acetonitrilo era de grado LC/MS y se compró a Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, EE.UU.). El suero fetal bovino se obtuvo de Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). La penicilina-estreptomicina-glutamina, el medio Eagle modificado de Dulbecco, la tripsina/EDTA, la solución salina equilibrada de Hank y el ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico se compraron a Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco F12 se obtuvo de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EE.UU.). La 6-Carboxifluoresceína se compró a AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, EE.UU.) y la 5-carboxifluoresceína se obtuvo de Acros Organics (Geel, Bélgica). Se utilizó agua Milli-Q plus (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) para todas las preparaciones.
Preparación y caracterización de la infusión de GT
La infusión se produjo remojando 2 o 4 g de GT en 50 mL de agua desionizada caliente (98-100 °C) durante 30 minutos. La infusión se filtró con una gasa mientras estaba caliente para obtener concentraciones de 40 y 80 mg/mL, respectivamente, que se administraron en fresco a las ratas por sonda gástrica.
Para la caracterización de la infusión de GT, tras la filtración de la infusión de GT con un filtro RC15 de 0,2 μm (Sartorious, Goettingen Alemania), se mezclaron 100 μL del filtrado con 900 μL de metanol y se centrifugaron para eliminar el precipitado. La infusión debidamente diluida (50 μL) se combinó con 50 μL de solución de 6,7-DMC (2,0 μg/mL en metanol) como estándar interno y 5 μL se sometieron al análisis LC-MS/MS. El sistema de HPLC incluía la bomba Accela 1250 y el automuestreador (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). La separación cromatográfica se logró utilizando una columna analítica Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) con un prefiltro. La fase móvil consistió en acetonitrilo con un 0,01% de ácido fórmico (A) y agua con un 0,01% de ácido fórmico (B) y se programó en forma de gradiente de la siguiente manera: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) y 2/98 (12 min). El caudal fue de 0,2 mL/min. El efluente de la columna se detectó mediante la sonda H-ESI (ionización por electrodifusión calentada) -II con el espectrómetro de masas Quantum Access MAX de triple etapa (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Se utilizó nitrógeno como gas de cubierta a 35 unidades arbitrarias y gas auxiliar a 10 unidades arbitrarias. La energía de colisión se fijó en -19/18 V, la tensión de pulverización en -3000/3000 V, la temperatura del capilar en 350 °C, la temperatura del vaporizador en 350 °C y el desplazamiento de la lente del tubo en -80/88 V. Se utilizaron las siguientes transiciones de masa para el análisis de seguimiento de reacciones seleccionadas (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) y 6,7-DMC (207/151). Los espectros ESI-MS se registraron en modo de iones negativos para EC, EGC, ECG y EGCG y en modo de iones positivos para 6,7-DMC.
Animales
Ratas Sprague-Dawley macho (270-360 g) fueron adquiridas en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán) y alojadas en un entorno acondicionado con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. La comida y el agua se adquirieron ad libitum hasta 12 horas antes de los experimentos. Las ratas se dividieron en dos grupos. En el primer experimento se utilizaron 28 ratas para determinar el efecto de la TG en los niveles séricos de IS y PCS en ratas CRF; en el segundo experimento se utilizaron 14 ratas para evaluar el efecto de la TG en la función renal de las ratas CRF. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo estrictamente las recomendaciones de »The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)» publicadas por la Sociedad China de Ciencia Animal, Taiwán, R.O.C. El protocolo experimental había sido revisado y aprobado el 08/01/2014 (Número de permiso: 103-126-N) por el Comité Insititucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de China, Taiwán, R.O.C.
Establecimiento del modelo de CRF y administración de la infusión de GT
El CRF se indujo mediante la administración oral de adenina siguiendo estudios anteriores, pero con algunas modificaciones19,23,35,36. Brevemente, se administró adenina suspendida en metilcelulosa 400 al 0,5% (15 mg/mL) por vía oral a 28 ratas a través de una sonda gástrica dos veces al día durante siete dosis consecutivas (15 mg/rata) a lo largo del periodo experimental. El día 4 se determinaron los niveles séricos de IS. Tras confirmar la atenuación de la función renal por la elevación significativa de los niveles séricos de IS, las ratas CRF se dividieron en tres grupos (8-10 ratas en cada grupo) con niveles de IS comparables. El primer grupo recibió 400 mg/5 mL/kg de infusión de GT dos veces al día durante siete dosis consecutivas; el segundo grupo recibió 200 mg/5 mL/kg de GT dos veces al día durante siete dosis consecutivas; y el tercer grupo recibió 5 mL/kg de agua en paralelo como control. El día 8, se administró a las ratas la 7ª dosis de GT a las 9:00 de la mañana después del ayuno nocturno y se recogieron las muestras de sangre a los 0, 15, 30, 60, 120, 180 y 360 minutos después de la dosis. La hora prevista para la recogida de sangre y la administración de adenina y GT se resume en la Fig. 3. En cada momento de la toma de muestras, se extrajeron 0,5 mL de sangre bajo anestesia de isoflurano. Las muestras de sangre se recogieron en microtubos y se centrifugaron a 10.000 g durante 15 min para obtener suero, que se almacenó a -20 °C antes del análisis.
Determinación de las concentraciones de IS y PCS en el suero
Para la determinación de las concentraciones de IS y PCS en el suero, se agitaron en vórtex 50 μL de la muestra de suero con 200 μL de metanol que contenía 10 μg/mL de 6,7-DMC o 100 μg/mL de metilparabeno como estándares internos, respectivamente, y se centrifugó para eliminar el precipitado, después se sometió una alícuota de 20 μL al análisis por HPLC.
Para las preparaciones de los calibradores, se añadieron 50 μL de suero con una serie de concentraciones de IS y PCS para obtener rangos de concentración de 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) y 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM), respectivamente. El procedimiento posterior siguió el descrito anteriormente para las muestras de suero. Las curvas de calibración se trazaron por regresión lineal de las proporciones del área de los picos (IS o PCS con respecto al estándar interno) frente a las concentraciones conocidas de IS y PCS, respectivamente.
El aparato de HPLC incluía una bomba (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japón), un detector de fluorescencia (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japón) y un inyector automático (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japón). La columna Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, EE.UU.) estaba equipada con una columna de guarda (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokio, Japón). La fase móvil consistió en acetonitrilo (A)-0,1% de ácido fosfórico (B) y se programó en forma de gradiente como sigue: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) y 15/85 (24-35 min) para IS y 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) y 16/84 (24-36 min) para PCS. Los ajustes del detector fueron Ex 280 nm/Em 375 nm para IS y Ex 214 nm/Em 306 nm para PCS. Los caudales fueron de 1,0 mL/min.
Efecto de la TG sobre la Cr y el BUN en ratas CRF
En otro experimento, se empleó el mismo protocolo animal mencionado anteriormente y se determinaron las concentraciones de Cr y BUN antes del tratamiento con adenina (Día 0), antes de la dosis de TG (Día 4) y después de la 7ª dosis de TG (Día 8). Al confirmar la atenuación de la función renal por la elevación significativa de la Cr y el BUN el día 4, las ratas CRF se dividieron en dos grupos (7 ratas por grupo) con niveles de Cr comparables. El primer grupo recibió 400 mg/5 mL/kg de GT dos veces al día durante siete dosis consecutivas; el segundo grupo recibió paralelamente 5 mL/kg de agua como control. El día 8, se administró a las ratas la séptima dosis de TG y agua tras el ayuno nocturno y se recogieron las muestras de sangre 30 minutos después. La Cr se determinó mediante un método cinético de picrato alcalino en un sistema químico ADVIA 2400 (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, EE.UU.). El BUN se analizó mediante la reacción de la enzima acoplada ureasa/glutamato deshidrogenasa utilizando el mismo analizador.
Línea celular y condiciones de cultivo
La construcción de las líneas celulares transfectadas de forma estable utilizadas para los estudios de transporte, células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan hOAT1 (CHO-hOAT1), células de riñón embrionario humano 293 (HEK) que expresan hOAT3 (HEK-hOAT3) y sus correspondientes líneas celulares de control transfectadas con vectores vacíos, se describió previamente40,41. Las células CHO se mantuvieron a 37 °C con un 5% de CO2 en un medio DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., EE.UU.) que contenía un 10% de suero, un 1% de penicilina/estreptomicina y 1 mg/mL de G418. Las células HEK se mantuvieron a 37 °C con un 5% de CO2 en medio DMEM de alta glucosa (Thermo Fisher Scientific Inc, EE.UU.) que contenía 10% de suero, 1% de penicilina/estreptomicina y 50 μg/mL de higromicina B. Las células se cultivaron en placas recubiertas de poli-D-lisina.
Preparación y caracterización de los metabolitos séricos de GT (GTM)
Para imitar las moléculas que interactúan con las OAT in vivo, se prepararon GTM de ratas y se caracterizaron. Brevemente, se administró por vía oral una infusión de GT (800 mg/10 mL/kg) a ratas en ayunas durante la noche. Se recogió sangre a los 15 minutos de la infusión de GT. Después de la coagulación, se recogió el suero y se mezcló en un vórtex con metanol de 3 veces. Tras la centrifugación a 10.000 g durante 15 minutos, el sobrenadante se concentró en un evaporador rotatorio al vacío hasta que se secó. Se añadió un volumen apropiado de agua al residuo para obtener una solución con una concentración de suero 10 veces mayor, que se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C para su uso posterior.
Se caracterizó una porción de GTM siguiendo un método anterior con algunas modificaciones16,46. Brevemente, se mezclaron 100 μL de muestra de suero con 50 μL de sulfatasa (que contenía 1000 unidades/mL de sulfatasa y 39.861 unidades/ml de ß-glucuronidasa), 50 μL de ácido ascórbico (200 mg/mL) y se incubaron a 37 °C durante 45 min en condiciones anaeróbicas. Tras la hidrólisis, el suero se añadió a 50 μL de HCl 0,1 N y luego se partió con 250 μL de acetato de etilo (que contenía 100 ng/mL de 6,7-DMC como estándar interno). La capa de acetato de etilo se evaporó bajo N2 hasta sequedad y se reconstituyó con un volumen apropiado de fase móvil antes del análisis LC-MS/MS. La fase móvil consistió en acetonitrilo (A) – agua con 0,1% de ácido fórmico (B) y se programó en forma de gradiente como sigue A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) y 2/98 (12 min). La velocidad de flujo fue de 0,2 mL/min.
Efectos del GTM en el transporte de captación mediado por hOAT1 y hOAT3
Se cultivaron células hOAT1 y HEK-hOAT3 (1 × 105 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos. Se utilizaron 6-carboxifluoresceína (6-CF) y 5-carboxifluoresceína (5-CF) como sondas para evaluar el efecto de GTM en la actividad de hOAT1 y hOAT3, respectivamente47,48. Además, se utilizó probenecid (80 μM) como control positivo para la inhibición de hOAT1 y hOAT349. Tras 24 o 48 horas de incubación de CHO-hOAT1 o HEK-hOAT3, se retiró el medio y se lavó tres veces con tampón PBS. Antes del experimento de transporte, las células CHO-hOAT1 y HEK-hOAT3 se preincubaron con los agentes de prueba (GTM y probenecid) a 37 °C. Tras 30 minutos de incubación, se añadió 6-CF o 5-CF y se incubó durante otros 5 min y 10 min, respectivamente. Las placas se colocaron inmediatamente en un baño de hielo y se retiraron los sobrenadantes y se lavaron las células tres veces con PBS frío. Posteriormente, se añadieron 100 μL de Tritón X-100 al 0,1% para lisar las células y se midió la fluorescencia con excitación a 485 nm y emisión a 528 nm. Para cuantificar el contenido de proteínas en cada pocillo, se añadieron 10 μL de lisado celular a 200 μL de reactivo de ensayo de proteínas diluido (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y se midió la densidad óptica a 570 nm. La acumulación intracelular relativa de 6-CF o 5-CF se calculó comparándola con la de los controles tras la corrección de proteínas.
Análisis de datos
La concentración sérica máxima (Cmax) se obtuvo a partir de la observación experimental. El área bajo la curva de concentración sérica – tiempo (AUC0-t) se calculó utilizando la regla trapezoidal hasta el último punto. Las diferencias de IS y PCS entre los tres grupos se analizaron mediante ANOVA unidireccional, mientras que la diferencia de Cr y BUN entre dos grupos se analizó mediante la prueba t de Student no apareada, tomando p < 0,05 como nivel significativo. También se utilizó la prueba t de Student no emparejada para el análisis de los ensayos in vitro.