Biol Res 41: 197-204, 2008
ARTICULO
Diferencias en la lipogénesis y lipólisis en adipocitos humanos adultos obesos y no obesos
MARIANA CIFUENTES, CECILIA ALBALA y CECILIA V ROJAS
Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INTA), Universidad de Chile, Santiago, Chile.
Dirección para Correspondencia
ABSTRACT
Se ha propuesto que las diferencias en la función y/o metabolismo de los adipocitos entre individuos obesos y delgados pueden manifestarse en anormalidades funcionales del tejido adiposo que conducen a trastornos metabólicos en la obesidad. Estudiamos la lipogénesis y la lipólisis de adipocitos omentales de humanos obesos (OB) y no obesos (NOB). La actividad específica de la enzima marcadora de la lipogénesis G3PDH era un 50% menor en los adipocitos totales de los sujetos OB en comparación con los de los NOB. Los adipocitos omentales de los sujetos con OB también presentaban un menor nivel lipolítico basal y una menor respuesta lipolítica al estímulo p-adrenérgico. La depleción de colesterol de la membrana plasmática de los adipocitos utilizando metil β-ciclodextrina causó un efecto lipolítico en los adipocitos de ambos grupos juntos, pero cuando se analizaron los sujetos obesos y delgados por separado, la respuesta fue significativa sólo en los obesos. Presentamos pruebas de un perfil lipogénico y lipolítico diferente en los adipocitos omentales de los individuáis obesos, y proponemos un papel relevante del colesterol de la membrana plasmática, donde el impacto de su eliminación en la lipólisis de los adipocitos OB y NOB difiere.
Términos clave: adipocito, colesterol, lipogénesis, lipólisis, obesidad, metabolismo de los triglicéridos.
INTRODUCCIÓN
El exceso de tejido adiposo visceral está relacionado con numerosos problemas de salud. Una adiposidad aumentada se asocia a un mayor volumen de células grasas. Así, los individuáis obesos tienen una cantidad relativamente grande de adipocitos hipertróficos en comparación con los sujetos delgados. Los estudios realizados en células grasas animales y humanas han establecido que varias funciones metabólicas de los adipocitos se ven alteradas con un mayor tamaño celular, como la sensibilidad a la insulina y el metabolismo de la glucosa, además de la secreción de adipoquinas y los perfiles de expresión genética (Bluher et al., 2004; Salans y Doherty, 1971; Salans et al., 1974; Smith, 1971; Yang et al., 2004). Esto ha llevado a sugerir que el predominio funcional de células hipertróficas y/o metabólicamente deterioradas en el tejido adiposo es un efecto causal importante para una baja respuesta del tejido a los signáis homeostáticos, perpetuando o exacerbando así el estado obeso. Para comprobar esta hipótesis, nos propusimos estudiar la lipogénesis y la lipólisis in vitro en adipocitos omentales aislados de adultos OB y NOB. Dado que la señalización de la lipólisis depende de las proteínas localizadas en las caveolas, y que la alteración de la organización de estas estructuras ricas en colesterol se ha asociado con alteraciones metabólicas en los adipocitos obesos (Le Lay et al., 2004), también evaluamos el impacto de la eliminación del colesterol de la membrana plasmática utilizando metil (β-ciclodextrina (M(βCD) en la lipólisis de los adipocitos OB y NOB.
Los presentes resultados subrayan un perfil lipogénico y lipolítico diferente entre sujetos delgados y obesos. Nuestros datos evidencian la relevancia metabólica del menor contenido de colesterol en la membrana plasmática de los adipocitos de los sujetos obesos, afectando a la regulación fisiológica de la lipólisis.
MATERIAL Y MÉTODOS
Aislamiento de adipocitos
Se obtuvo grasa omental humana de 25 sujetos obesos (OB) y no obesos (NOB) sometidos a cirugía abdominal electiva (ya sea bypass gástrico, ginecológica o gastrointestinal). El rango de edad de los sujetos era de 29 a 79 años y su índice de masa corporal (IMC) oscilaba entre 18 y 54 kg/m2. El punto de corte para definir la obesidad se consideró según la definición del NIH de IMC > 30 kg/m2. Doce sujetos (9 hombres, 3 mujeres) eran NOB (IMC 23,3 ± 3,4 kg/m2), mientras que 13 eran OB (IMC 38,2 ± 4,3 kg/m2; 4 hombres, 9 mujeres). No se observó ninguna influencia del género en los parámetros estudiados. El protocolo fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional del INTA, Universidad de Chile, y los donantes firmaron el consentimiento informado. El tejido adiposo extraído durante la cirugía fue sumergido en solución salina y transportado al laboratorio para ser procesado en una hora. A su llegada, el tejido se lavó varias veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), eliminando todo el tejido conectivo visible, los coágulos de sangre y los vasos, y luego se picó en trozos pequeños (2-3 mm2) y se cultivó en médium MI99 (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado con antibióticos (penicilina-estreptomicina) a 37°C en una incubadora de atmósfera controlada. El periodo de incubación del tejido fue de 2 días para minimizar la variabilidad interindividual causada por factores del sujeto como el medio hormonal, el estado de salud actual o la medicación. Los adipocitos se aislaron mediante un método basado en el trabajo de Rodbell (1964). Brevemente, se incubó tejido adiposo picado con lg/1 de colagenasa tipo I (Worthington Biochemical Corp. Lakewood, NJ) a 37°C durante 60 minutos con mezcla continua. La suspensión celular resultante se filtró a través de una gasa estéril, y como los adipocitos se separaban espontáneamente de la fase acuosa, se recuperaron aspirando suavemente la capa flotante con una pipeta plástica, y se lavaron dos veces con 5 volúmenes de HBSS. Los adipocitos aislados se utilizaron inmediatamente para los estudios de lipólisis, o se congelaron para la posterior determinación de la glicerol-β-fosfato deshidrogenasa (G3PDH).
La respuesta lipolítica al estímulo β-adrenérgico y la detección de la actividad lipogénica (véase más adelante) evidenciaron la presencia de adipocitos viables tras la digestión del tejido.
Lipogénesis y lipólisis
La síntesis de triglicéridos en el adipocito utiliza tanto ácidos grasos preelaborados como de novo, mientras que la columna vertebral de glicerol proviene del glicerol-β-fosfato derivado de la glucosa. La capacidad lipogénica se evaluó mediante la actividad específica de la enzima G3PDH, que cataliza la formación de la columna vertebral de glicerol de los triglicéridos a partir del fosfato de dihidroxiacetona proporcionado a través de la glucólisis. Esta enzima se considera limitante de la tasa de síntesis de triglicéridos en el tejido adiposo, dado que en este tejido es la fuente solé de glicerol-β-fosfato. Su uso como marcador lipogénico en los adipocitos maduros está respaldado por la regulación al alza de su ARNm y su actividad por la insulina (Moustaid et al., 1996; Rumberger et al., 2003). Brevemente, los adipocitos aislados fueron homogeneizados (10 golpes a 1800 rpm con un sistema de homogeneización Glas-Col, Glas-Col, IN) utilizando un tubo de vidrio equipado con un mortero de teflón, a 4°C en un tampón que contenía 0,25M de sacarosa, lmM de EDTA, 50mM de trietanolamina y lmM de ditiotreitol. El homogeneizado se centrifugó a 14.000 x g, 4°C durante 30 minutos. La actividad de la G3PDH se determinó en el sobrenadante basándose en el método de Kozak y Jensen (1974), midiendo la oxidación del NADH (curso temporal del cambio de absorbancia a 340 nm a 37°C) en un lector de microplacas (EL-808, BioTek Instruments Inc, Winooski, VT), utilizando fosfato de dihidroxiacetona como sustrato para la enzima. La reacción fue lineal con respecto al tiempo durante el período de ensayo. Una unidad de actividad enzimática corresponde a la oxidación de 1 nmol de NADH por minuto en las condiciones indicadas anteriormente. La concentración de proteínas en el extracto soluble se midió mediante el método de Bradford (Bradford, 1976).
La lipólisis se evaluó durante las 48 horas de cultivo adiposo mediante la medición del glicerol acumulado liberado en el medio de cultivo MI99 (reactivo de determinación de glicerol libre, Sigma, St Louis MO). Además, la respuesta lipolítica aguda al (estímulo β-adrenérgico, con o sin agotamiento del colesterol de la membrana plasmática (60 min de preincubación con 10 mM de MβCD ), se evaluó midiendo el glicerol total liberado durante una incubación de 90 minutos de suspensiones de adipocitos al 10% a 37°C con suave agitación continua y la adición de 10μM de isoproterenol (Sigma) o vehículo. Para la evaluación de la lipólisis durante el cultivo de tejido adiposo, los valores de glicerol se expresan por mg de tejido, mientras que para el ensayo de la lipólisis en las suspensiones de adipocitos, los valores se normalizan con respecto a los lípidos celulares totales, según lo descrito por Carpéné (2001) o, en los experimentos con agentes lipolíticos, con respecto al respectivo control basal (no estimulado). Los lípidos celulares totales se extrajeron utilizando el método de Dolé y Meinertz (1960), y se determinaron gravimétricamente. A la luz de una relación independiente comunicada entre el tamaño celular y la lipólisis que puede actuar como factor de confusión, especialmente en nuestros estudios que comparan sujetos OB y NOB, la expresión por mg de lípidos se consideró la más adecuada. Como demostraron Large et al. (1999), la reléase de glicerol expresada por contenido de lípidos está altamente correlacionada con la actividad de la lipasa sensible a las hormonas en estudios de sujetos humanos obesos y delgados, y es más relevante para la capacidad lipolítica que por el número de células debido al mayor volumen de células grasas en los obesos.
Estadística
Las diferencias entre medias se analizaron mediante la prueba t de Student y se consideraron significativas a p≤0,05. El coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para evaluar las asociaciones de las variables continuas. Los datos se expresan como medias ± SEM.
RESULTADOS
Lipogénesis
La actividad específica de la enzima lipogénica G3PDH era casi la mitad en los sujetos con OB en comparación con la de los adipocitos de NOB (p<0,05, Fig. 1). En consonancia con esto, hubo una correlación inversa significativa entre el marcador de lipogénesis y el IMC de los sujetos (Fig. 1, recuadro, r2=0,31, p=0,01). Cabe destacar que no hubo diferencias en la concentración de proteínas (utilizadas para normalizar la actividad de la G3PDH) entre los sujetos OB y NOB que pudieran haber sesgado estos resultados.
Lipólisis
La reléase de glicerol al medio de incubación durante el cultivo de tejido adiposo omental entero o adipocitos aislados se utilizó como indicador de la actividad lipolítica. Tanto la lipólisis basal como la estimulada por el isoproterenol fueron menores en los adipocitos aislados de los sujetos con OB (p<0,05 y p<0,01, respectivamente, Fig. 2). En consonancia con estas observaciones, hubo una correlación inversa altamente significativa entre la lipólisis y el IMC del sujeto para el tejido completo (r2=0,46, p<0,0005, recuadro, Fig. 2) y los adipocitos aislados (basal: r2=0,28, p<0,01; β-estimulado por adrenérgicos: r2=0,17, p<0,05, n=20). Los adipocitos de los sujetos obesos mostraron una menor respuesta al (estímulo β-adrenérgico en comparación con los de sus homólogos delgados (Fig. 3, p<0,05).
La exposición de los adipocitos a 10 mM de MβCD en un subconjunto de 11 muestras provocó un aumento significativo de la lipólisis basal. Este aumento fue directamente proporcional al IMC del sujeto (r2=0,5, p<0,05, Fig. 4). La respuesta lipolítica a la estimulación β-adrenérgica se redujo significativamente cuando los adipocitos fueron expuestos a M(βCD (345 ± 50 % frente a 199 ± 33 %, respectivamente, p< 0,05). Curiosamente, al comparar el efecto del M(βCD frente al vehículo, se observó una reducción significativa de la respuesta lipolítica al isoproterenol en los adipocitos de sujetos con IMC>40 kg/ m2 (obesos mórbidos, según la definición de los NIH), mientras que los sujetos delgados no mostraron diferencias significativas (Fig. 5). En consonancia con esto, se encontró una correlación significativa entre el IMC y la relación de la respuesta lipolítica a 10μM de isoproterenol en presencia y ausencia de 10 mM de M(βCD (r2=0,46, p<0,05).
DISCUSIÓN
En el presente trabajo, hemos estudiado la lipogénesis y la lipólisis en adipocitos aislados del tejido adiposo omental de adultos OB y NOB dentro de un amplio rango de IMC (18-54 kg/m2). Nuestras observaciones muestran que la actividad específica del marcador de lipogénesis G3PDH en los OB era la mitad que en los adipocitos de sus homólogos NOB. Por otra parte, los IMC más elevados se asociaron a una menor lipólisis basal y (β-estimulada por la adrenalina) y a una mayor sensibilidad al deterioro de la señalización de la membrana plasmática debido a la eliminación del colesterol. Una mayor acumulación de triglicéridos en el adipocito OB puede estar relacionada con la menor actividad lipolítica que observamos en este grupo, como también han propuesto otros (Langin et al., 2005). Además, la menor actividad específica de la G3PDH que encontramos en el OB, que puede resultar contraria a la intuición, podría representar una menor capacidad para almacenar el exceso de triglicéridos circulantes, lo que probablemente dé lugar a una hipertrigliceridemia y a la acumulación de grasa en otras regiones del cuerpo, con los conocidos efectos perjudiciales asociados al síndrome metabólico.
Usando un enfoque in vivo en humanos, Dodt et al. (2003) observaron una respuesta lipolítica atenuada a la estimulación intraneural en mujeres obesas, lo que coincide con nuestros resultados in vitro y apoya la idea de que la obesidad puede estar asociada, al menos en parte, a una baja respuesta lipolítica a la activación simpática. En consonancia, Gómez-Ambrosi et al. (2004) estudiaron el patrón de expresión génica del tejido adiposo omental y demostraron que los sujetos obesos tenían una expresión disminuida y aumentada de los genes inductores y represores de la lipólisis, respectivamente.
Existen considerables discrepancias en la literatura respecto a la normalización de los datos de la lipólisis. Dada la relación directa comunicada entre el tamaño de las células de los adipocitos y la lipólisis (Large et al., 1999), y la mayor abundancia relativa de adipocitos de mayor tamaño en los obesos (Large et al., 1999), se espera que el tejido adiposo muestre una mayor lipólisis no ajustada entre los obesos que entre los individuos NOB. Así, para evitar un factor de confusión debido a la diferente distribución del tamaño de las células en los OB frente a los NOB, nuestros valores de reléase de glicerol se normalizaron expresándolos por mg de lípido total, evaluando así la actividad lipolítica para una masa lipídica determinada. En apoyo de esto, los estudios de humanos obesos y delgados han observado una alta correlación entre la actividad de la enzima lipolítica clave HSL (Upasa sensible a las hormonas) y la reléase de glicerol de los adipocitos expresada por el contenido de lípidos (Large et al., 1999). Los autores afirmaron que el contenido lipídico es más relevante para la capacidad lipolítica que la normalización por número de células, debido al mayor volumen de células grasas en los obesos. Cabe destacar que (la estimulación β-adrenérgica sobre las condiciones basales también resultó ser menor en los sujetos con OB, y esta valoración es independiente del tamaño o número celular, dado que se normaliza con el control correspondiente (cada valor basal).
El papel del contenido de colesterol de la membrana para la integridad de las caveolas, la transducción de señales específicas y la función celular adecuada ya ha sido reconocido (Le Lay et al. 2001). Se ha demostrado que los adipocitos hipertróficos tienen un metabolismo deteriorado, junto con un menor contenido de colesterol en la membrana plasmática (Le Lay et al. 2001). Nuestras observaciones amplían las de Le Lay et al. (2001, 2004) que demostraron que la reducción del colesterol en los adipocitos induce resistencia a la insulina y cambios en la expresión de una serie de genes relevantes para el metabolismo adiposo. Estos resultados fueron proporcionados como evidencia de la reducción del colesterol en la membrana plasmática como un vínculo entre la hipertrofia de los adipocitos y el deterioro metabólico, lo cual es apoyado por nuestros resultados actuales. Nuestros experimentos exponiendo a los adipocitos a M(βCD causaron un aumento significativo de la lipólisis basal (esperada tras alterar la integridad de las caveolas de la membrana plasmática, resultando en una disminución de la actividad de la fosfodiesterasa 3B ) y, en consecuencia, en una menor respuesta lipolítica al (estímulo β-adrenérgico. Curiosamente, observamos una asociación significativa entre el impacto de la M(βCD en la lipólisis basal y el IMC. Además, la correlación significativa entre el IMC y la relación entre el isoproterenol y la lipólisis basal en presencia y ausencia de M(βCD apoyan una mayor susceptibilidad de los adipocitos de los sujetos obesos a la señalización alterada de la membrana plasmática impulsada por el agotamiento del colesterol.
Las células grasas agrandadas, que se sabe que son más abundantes a medida que aumenta el IMC de los sujetos (Julien et al., 1989; Salans et al., 1973; Van Harmelen et al., 2003) son resistentes a la insulina (Olefsky 1977) y muestran un patrón de secreción distinto que las ha relacionado con los trastornos asociados a la obesidad (Imbeault et al., 1999; Van Harmelen et al., 2000).
Es interesante que los ratones knockout del receptor de insulina específico del tejido adiposo (Bluher et al., 2004) muestran una polarización de los adipocitos en dos subpoblaciones de células pequeñas (<50μm de diámetro) y grandes >1OOμm), que se acompaña de diferencias en la síntesis de triglicéridos y la lipólisis, entre otros parámetros. Las observaciones aquí reportadas muestran diferencias intrínsecas en el metabolismo de los triglicéridos entre los adipocitos omentales de sujetos OB y NOB, y proponemos que el enriquecimiento en adipocitos hipertrofiados y privados de colesterol en la membrana puede estar impulsando tales alteraciones. Es posible que la respuesta lipolítica alterada contribuya con el tiempo al aumento del depósito de triglicéridos. La capacidad reducida de almacenar triglicéridos adicionales, daría lugar a un aumento de la cantidad de lípidos circulantes, elevando los riesgos asociados al síndrome metabólico.
Hasta donde sabemos, ningún otro estudio ha evaluado la lipogénesis y la lipólisis en adipocitos omentales de sujetos humanos OB y NOB. El presente trabajo muestra diferencias relevantes en el metabolismo de los triglicéridos de los adipocitos omentales en los sujetos obesos en comparación con los no obesos y sugiere que los adipocitos de los individuáis obesos son más susceptibles a la reducción del contenido de colesterol en la membrana plasmática. Aunque pretendíamos minimizar los factores del sujeto, no podemos descartar que las comorbilidades presentes en los sujetos obesos puedan estar influyendo en el diferente comportamiento de las células grasas. La comparación del manejo de los triglicéridos entre estos grupos y en un depósito de grasa de tanta relevancia patogénica ayuda a comprender las diferencias en el metabolismo y la capacidad de respuesta, que pueden ser objetivo de intervención farmacológica y requieren más estudios.
AGRADECIMIENTOS
Deseamos agradecer al Dr. Miguel A. Celis del Hospital Tisné, al Dr. Leonardo Rodríguez del Hospital DIPRECA y a los Dres. Cristian Cavalla, James Hamilton y Gonzalo Wiedmaier del Hospital Padre Hurtado por la inestimable ayuda en la obtención de tejido graso, así como a la sra. Marisol Blanco y el Sr. Rodrigo Brücher por su asistencia técnica.
Apoyo de becas
Apoyado por becas del DI-U de Chile (N°s Mult 04/06-2 a C. Rojas y 1-04/01-2 a M. Cifuentes), y FONDECYT (N° 1070632 a C. Rojas, N°1080232 a M. Cifuentes).
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