Citrobacter freundii fitness durante la infección del torrente sanguíneo

Recogida de aislados de Citrobacter BSI

En comparación con otras especies Gram negativas que causan regularmente BSI, se dispone de poca información sobre la fisiología de C. freundii en el entorno del huésped. Con el objetivo de subsanar esta carencia, primero recogimos ocho aislados pertenecientes al complejo C. freundii de pacientes con ISB dentro del Sistema de Salud de la Universidad de Michigan. La filogenia basada en el ARN ribosómico es capaz de distinguir tres grupos de especies de Citrobacter, de los cuales, el grupo I abarca al menos ocho especies e incluye a C. freundii23,24. Sin embargo, la secuencia del ARNr 16S y los enfoques de identificación basados en la espectrometría de masas ofrecen una resolución filogenética limitada dentro de este grupo de especies de Citrobacter. Por lo tanto, los aislados utilizados en este estudio se evaluaron además mediante un enfoque de análisis de secuencias multilocus. De los ocho aislados recogidos, seis se agruparon estrechamente con cepas establecidas de C. freundii (Fig. 1) y tenían una identidad nucleotídica media de >98% con la cepa tipo ATCC 8090, que está por encima del límite típicamente aceptado del 95% para los aislados de la misma especie. De los dos aislados restantes, UMH17 se agrupó más estrechamente con la cepa tipo de Citrobacter pasteurii CIP 55.13 y UMH18 con las cepas de Citrobacter werkmanii.

Bacteriemia de C. freundii

Antes de investigar los requisitos de aptitud de Citrobacter durante la BSI, se desarrolló un modelo murino de bacteriemia basado en trabajos anteriores con otras especies entéricas25. Entre los aislados de Citrobacter BSI, se eligieron las cepas UMH14 y UMH15 como candidatas para su uso en este estudio. La cepa UMH14 mostró una colonización más consistente y dependiente de la dosis en el bazo y el hígado a las 24 horas de la inyección en la vena de la cola (Fig. S1) y fue seleccionada para una mayor caracterización. También fue necesario probar el modelo de infección para detectar posibles cuellos de botella de colonización antes de evaluar la contribución de los genes individuales de C. freundii a la aptitud utilizando una gran colección de mutantes de transposones. Se aisló un mutante espontáneo de UMH14 resistente al ácido nalidíxico (UMH14Nal) y se determinó que tenía una aptitud in vitro equivalente durante el cocultivo con la cepa madre en medio rico (Fig. S2). Para determinar si se podía establecer una población diversa de mutantes en el torrente sanguíneo sin la pérdida estocástica de clones individuales, las cepas UMH14Nal y UMH14 se mezclaron en diferentes proporciones y se inocularon en ratones. Después de 24 horas, se toleraron proporciones de hasta 1:10.000 (UMH14Nal:UMH14) sin pérdida espontánea de la cepa subrepresentada en el bazo (Fig. S2), lo que indica que un solo ratón podría albergar al menos 10.000 mutantes de transposón únicos a una dosis total de 5 × 107 bacterias utilizando este modelo.

Para identificar los genes de aptitud de Citrobacter en el modelo de bacteriemia, se inyectaron en ratones cinco grupos de mutantes de inserción de transposones al azar que representaban >44.000 sitios de inserción únicos y se recuperaron las bacterias que colonizaban el bazo después de 24 horas (Fig. S3). La abundancia relativa de los mutantes de transposones individuales en el inóculo y en los productos esplénicos, determinada por la secuenciación de alto rendimiento, se utilizó para identificar los genes que contribuyen a la supervivencia bacteriana en el modelo. Un total de 177 genes interrumpidos por el transposón confirieron una pérdida significativa de aptitud y nueve genes se asociaron con un aumento de la aptitud bacteriana cuando mutaron (cambio de pliegues ≥2,0, P Adj. < 0,05) (Datos S1). Un segundo análisis con este conjunto de datos identificó 546 genes esenciales putativos codificados por el cromosoma para los que el número de lecturas en la población de entrada era significativamente menor de lo esperado según los sitios TA disponibles y el tamaño de la población de la biblioteca (logFC <-5,17) (Datos S2). Utilizando este modelo de infección oportunista y sistémica, se anticipó que la mayoría de los factores de aptitud identificados representarían procesos fisiológicos básicos en lugar de factores de virulencia prototípicos (por ejemplo, toxinas proteicas o adhesinas). De hecho, la categorización de los 177 genes asociados con defectos significativos de fitness por Grupos Ortólogos (COG) reflejó el predominio de las vías metabólicas y las funciones de mantenimiento celular requeridas durante la bacteriemia de C. freundii (Fig. 2). Aproximadamente la mitad de los genes de fitness identificados encajan ampliamente en cinco categorías de COG que abarcan la producción de energía, el metabolismo de aminoácidos, la replicación y reparación del ADN, la traducción y la biogénesis de la pared celular y la membrana.

Validación de mutantes de genes de aptitud individuales

La contribución de los productos de genes individuales a la aptitud de C. freundii se confirmó con mutaciones de deleción-inserción independientes construidas en genes UMH14 seleccionados (Tabla 1). Todas las cepas modificadas aquí carecían de defectos de replicación graves, según se determinó por el crecimiento en medio rico (Fig. S4). Para cada gen enumerado en la Tabla 1, se midió la aptitud mediante la coinfección de mutantes individuales con la cepa madre UMH14. Cinco de los siete mutantes probados inicialmente mostraron una desventaja competitiva estadísticamente significativa en el bazo o en el hígado (Fig. 3A), afirmando así los resultados del cribado de transposones. El mutante znuB se seleccionó como control negativo para la validación aquí, ya que los resultados del cribado de transposones indicaron que no había ningún defecto de aptitud asociado a este gen, a pesar de las pruebas de otras especies bacterianas que demuestran la contribución del sistema de transporte de zinc ZnuABC a la infección murina26,27,28. En competencia con UMH14, el mutante znuB no mostró un defecto de aptitud significativo, de acuerdo con los resultados esperados. Los genes adyacentes znuA (cambio de pliegues = 1,5, P adjunto = 0,527) y znuC (cambio de pliegues = 2,0, P adjunto = 0,035) de UMH14 tampoco confirieron ningún defecto de aptitud o un defecto mínimo cuando fueron mutados por inserción de transposones (Datos S1).

La mutación del gen tatC, que codifica un componente del sistema de translocación de arginina gemela, produjo la mayor pérdida de aptitud entre todos los mutantes probados (Fig. 3). Para determinar si la disminución de la aptitud de este mutante podía restablecerse mediante complementación genética, se introdujo en el mutante tatC el plásmido pBBR1MCS-5 que alberga el marco de lectura abierto de tatC y se comprobó la aptitud relativa de la cepa resultante. El mutante tatC mostró inicialmente un defecto de fitness de 67 veces en el bazo en competencia con la cepa de tipo salvaje (Fig. 3A), mientras que el mutante tatC complementado sólo mostró un defecto de fitness de dos veces en las mismas condiciones (Fig. 3B). Del mismo modo, el mutante tatC complementado no sufrió una competencia significativa en el hígado en comparación con UMH14. Se sabe que el plásmido padre pBBR1MCS-5 se mantiene de forma estable durante la infección en ausencia de selección29 y el cultivo in vitro del mutante tatC de C. freundii que alberga pBBR1MCS-5 o el plásmido de complementación tatC+ no demostró una pérdida apreciable de plásmido durante 24 horas en ausencia de selección (Fig. S5). En conjunto, estos resultados establecen firmemente el requisito de la función de TatC durante la bacteriemia de Citrobacter.

Conservación de los genes de aptitud entre los aislados de Citrobacter

Durante el curso de este estudio, se determinó la secuencia completa del genoma de cada aislado de Citrobacter y se comparó el proteoma predicho de cada cepa con UMH14 como referencia. De los 4.666 productos génicos predichos codificados en el cromosoma UMH14, 3.742 se conservan con una identidad ≥95% entre todos los aislados de C. freundii de este estudio (Fig. 4A). El número de proteínas conservadas (≥95% de identidad) entre todas las cepas disminuye a 2.545 cuando se incluyen los proteomas predichos de UMH17 y UMH18, lo que concuerda con la colocación de estos aislados fuera de la rama de C. freundii mediante el análisis de secuencias multilocus (Fig. 1). La conservación de los factores de aptitud de UMH14 también fue alta, con 145 de las 177 proteínas predichas conservadas en ≥95% de identidad de aminoácidos entre las ocho cepas de bacteriemia (Fig. 4B), incluyendo los siete factores de aptitud iniciales que fueron seleccionados para la validación (Tabla 1 y Fig. 3). Al eliminar UMH17 y UMH18, el número de factores de aptitud conservados aumentó a 162 (92%). Estos resultados sugieren una estrategia de supervivencia de Citrobacter durante la bacteriemia que depende en gran medida de proteínas conservadas dentro de la especie. Curiosamente, pocos factores de aptitud eran completamente únicos (<30% de identidad) para UMH14 dentro de este subconjunto de cepas. Un ejemplo notable es un operón putativo de tres genes (CUC46_23440-CUC46_23450) con defectos de aptitud observados que oscilan entre 6 y 14 veces. Los tres marcos de lectura abiertos codifican proteínas hipotéticas y, entre ellas, sólo se predice que CUC46_23450 codifica un dominio conservado con una función asignada (cd01713, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa).

Vías de recombinación y reparación del ADN

Uno de los objetivos de este estudio era identificar vías biológicas conservadas que implicaran a múltiples factores de fitness de la bacteria. Los complejos enzimáticos RecBCD y RuvABC que participan en la recombinación y reparación del ADN representan un ejemplo de ello. La enzima RecBCD es activa en los extremos del ADN dúplex y es necesaria para los procesos de recombinación homóloga y reparación recombinacional del ADN. En relación con estas funciones, la enzima RuvABC facilita la migración de la rama de la unión Holliday y su resolución30,31. La inserción de transposones en recB, recC o recD resultó en una reducción de 6-8 veces en la aptitud y, de forma similar, la interrupción de ruvA y ruvC por inserción de transposones resultó en una pérdida de aptitud >30 veces (Datos S1). Es importante destacar que el defecto de aptitud de ruvA fue confirmado por la infección de competencia contra la cepa de tipo salvaje utilizando un mutante construido de forma independiente (Fig. 3A). Dentro de los dos complejos multiproteicos, sólo RuvB no fue identificado como un factor de fitness significativo en nuestro conjunto de datos. Se sabe que ambos complejos proteicos participan en la resolución de las horquillas de replicación del ADN estancadas o colapsadas que se producen durante la síntesis cromosómica normal30, aunque es importante destacar que el mutante ruvA creció de forma similar a la cepa de tipo salvaje durante la replicación rápida en medio rico (Fig. S4). Es tentador especular que el daño al ADN bacteriano que se produce en el entorno del huésped, potencialmente a través de la producción de especies reactivas de oxígeno mediada por las células inmunitarias, también puede contribuir a la necesidad de estos complejos.

El sistema de translocación de doble arginina

El sistema de translocación de doble arginina funciona en las especies bacterianas Gram negativas para secretar proteínas plegadas a través de la membrana citoplasmática. El papel de TatC en este sistema multiproteico conservado consiste en el reconocimiento de las secuencias de señales de secreción para las proteínas que se exportan a través de esta vía. Habiendo establecido el impacto significativo del gen tatC en la aptitud in vivo de C. freundii (Fig. 3), se razonó que las proteínas secretadas por el sistema Tat también podrían ser necesarias para la aptitud en el modelo murino. Para identificar las posibles proteínas secretadas por Tat, se analizó la secuencia N-terminal de cada uno de los 177 factores de fitness utilizando el software de predicción TatP 1.032. Se identificaron dos genes, CUC46_16565 y CUC46_16060, que codifican péptidos señal dependientes de Tat que contienen motivos de doble arginina. El producto CUC46_16565 comparte un 94% de identidad de aminoácidos con la proteína SufI de E. coli, incluyendo un 100% de conservación del motivo de la doble arginina y la porción hidrofóbica del péptido señal33. Se mutó el gen sufI de C. freundii y se evaluó la aptitud en competencia con la cepa madre UMH14 para determinar si alguno de los defectos de aptitud asociados a la pérdida de TatC podía atribuirse a la interrupción de la función de SufI (Fig. 5A). De hecho, la cepa mutante sufI fue superada por 7 veces en el bazo y 17 veces en el hígado en comparación con la cepa de tipo salvaje. Sin embargo, dado que el coste de fitness de la mutación tatC osciló entre 67 y 112 veces en competencia con las bacterias de tipo salvaje (Fig. 3), el coste de aptitud comparativamente bajo de la mutación sufI implicaba que otros sustratos dependientes de Tat también podrían contribuir a la aptitud. Los intentos de establecer la secreción dependiente de Tat de SufI en C. freundii no tuvieron éxito debido a los aparentes problemas de toxicidad asociados con la expresión de una construcción de SufI etiquetada con FLAG C-terminal, específicamente dentro de la cepa mutante tatC (datos no mostrados). Sin embargo, SufI se ha utilizado como proteína segregada por Tat modelo en numerosos estudios de caracterización del sistema Tat de E. coli.

El segundo factor potencial de aptitud secretado por Tat que se identificó, codificado por CUC496_16060, es una prolina aminopeptidasa predicha (PRK10879) que pertenece a la superfamilia PepP. Una cepa mutante que carece del gen pepP fue superada por cerca de 3 veces en el bazo y cerca de 2 veces en el hígado, pero la desventaja de fitness observada en comparación con el tipo salvaje no fue estadísticamente significativa (Fig. 5A). No obstante, se determinó la localización subcelular de PepP utilizando un derivado marcado con el epítopo C-terminal FLAG en un plásmido multicopia (PepPFLAG). Se detectaron niveles inesperadamente bajos de PepPFLAG en el mutante tatC en comparación con UMH14; sin embargo, la proteína de fusión PepPFLAG se encontró principalmente en la fracción citoplasmática de ambas cepas analizadas (Fig. S6) y no se obtuvieron pruebas de la localización subcelular dependiente de Tat de la proteína PepP. Junto con los resultados de la infección por competencia del mutante sufI, estos datos apoyan aún más la noción de que existen factores de aptitud adicionales dependientes de Tat en C. freundii o que la pérdida acumulativa de la translocación de proteínas a través del sistema Tat supera la pérdida de función para cualquier sustrato individual.

Uno de los fenotipos predominantes asociados con los mutantes tat de pérdida de función en todas las especies es un deterioro de la motilidad34,35,36,37. C. freundii es una bacteria flagelada capaz de nadar en una matriz de agar blanda. El mutante tatC de C. freundii mostró una reducción de aproximadamente 2 veces en la motilidad de natación en comparación con la cepa de tipo salvaje y la motilidad de natación fue totalmente restaurada por la complementación genética en trans (Fig. 5B,C). Estos resultados demuestran claramente un defecto de motilidad en ausencia de la función de TatC; sin embargo, dado que todavía se observó una natación de bajo nivel en el mutante tatC, es probable que se conserve alguna función flagelar. Con la excepción de fliQ, la falta general de genes de aptitud asociados a los flagelos identificados durante la bacteriemia sugiere que la importancia de tatC para la aptitud de C. freundii puede ser en gran medida independiente de la disfunción de los flagelos observada en esta cepa.

Vías de aptitud metabólica

Como se señaló anteriormente, se predijo que una parte considerable de los genes de aptitud identificados de Citrobacter funcionaban en vías metabólicas (Fig. 2). Tres genes diferentes que representan componentes del metabolismo central del carbono (pfkA), del metabolismo de la fructosa y la manosa (mtlD) y de la biosíntesis de aminoácidos (cysE) fueron elegidos para una investigación más profunda. La biosíntesis bacteriana de la cisteína se produce a partir de la L-serina a través del intermediario O-acetil-L-serina (OAS). Este primer paso en la vía modelo de E. coli está catalizado por la enzima O-acetiltransferasa CysE y la pérdida de cysE da lugar a una auxotrofia de cisteína38,39. Un mutante de C. freundii cysE es igualmente incapaz de replicarse en un medio definido que carece de cisteína (Fig. 6A), pero puede alcanzar densidades cercanas a las del tipo normal cuando el medio se complementa con OAS (Fig. 6B) o cisteína (Fig. 6C). La complementación genética de la mutación cysE dio como resultado la restauración parcial del crecimiento en ausencia de cisteína. Curiosamente, la falta total de crecimiento de las bacterias mutantes cysE en ausencia de OAS o cisteína in vitro contrasta con el defecto de aptitud parcial observado durante la infección (Fig. 3A). Esto sugiere que Citrobacter puede ser capaz de obtener estos metabolitos del entorno del torrente sanguíneo, aunque sigue habiendo un coste de fitness asociado a la interrupción de la vía biosintética.

Como parte de nuestra investigación sobre el metabolismo asociado al huésped de Citrobacter, se investigó la capacidad de esta bacteria para utilizar diferentes fuentes de carbono. La enzima fosfofructoquinasa PfkA de otras especies entéricas ha sido ampliamente caracterizada y representa el primer paso comprometido en la glucólisis, catalizando la fosforilación de la fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato. En el caso de UMH14, la mutación de pfkA eliminó la capacidad de esta cepa para replicarse con glucosa como única fuente de carbono (Fig. 6D), que pudo restaurarse parcialmente proporcionando pfkA en un plásmido multicopia. Esta pérdida total de la utilización de la glucosa in vitro se correlaciona con una disminución del doble de la aptitud durante la bacteriemia (Fig. 3A). Como la glucosa es una fuente de carbono abundante en el suero de los mamíferos40, estos resultados son consistentes con un papel para la utilización de la glucosa por parte de Citrobacter durante la infección, pero también sugieren que el repertorio metabólico de Citrobacter puede facilitar la utilización de fuentes alternativas de carbono y energía.

También se investigó la contribución de una segunda actividad enzimática que implica a la fructosa-6-fosfato en la bacteriemia de Citrobacter. La proteína manitol-1-fosfato-5-deshidrogenasa, MtlD, facilita la conversión bidireccional de manitol-1-fosfato y fructosa-6-fosfato utilizando NAD+ o NADH como cofactor41,42. Múltiples especies bacterianas entéricas pueden utilizar el alcohol de azúcar manitol como única fuente de carbono tras su transporte a través de un sistema de fosfotransferasa dependiente del hexitol fosfoenolpiruvato, lo que resulta en la acumulación intracelular de manitol-1-fosfato43,44. Un posible destino del manitol-1-fosfato es la oxidación dependiente de MtlD a fructosa-6-fosfato y su posterior canalización en la vía glicolítica. El mutante mtlD de C. freundii mostró una disminución de la aptitud cinco veces mayor en el hígado murino (Fig. 3A) y esta observación impulsó los experimentos para determinar si C. freundii era capaz de este tipo de metabolismo in vitro. Las cepas UMH14 y las derivadas de mtlD se cultivaron en un medio definido que contenía manitol y las curvas de crecimiento resultantes demuestran que las bacterias de tipo salvaje y el mutante complementado fueron capaces de proliferar en estas condiciones, mientras que la cepa mtlD no pudo (Fig. 6E). Como se esperaba, el mutante mtlD fue capaz de replicarse hasta niveles cercanos a los del tipo salvaje cuando se le proporcionó glucosa como fuente de carbono en condiciones aeróbicas (Fig. 6F). En conjunto, estos resultados establecen tanto la capacidad de C. freundii para utilizar manitol como única fuente de carbono como el requisito de mtlD en este proceso.

Estrategias de fitness compartidas entre patógenos en el entorno del torrente sanguíneo

Hemos evaluado previamente los requisitos de fitness de otro patógeno oportunista, S. marcescens, utilizando un modelo murino similar de bacteriemia. Los resultados del estudio de S. marcescens incluían la identificación de 212 genes de fitness utilizando técnicas similares a las del presente trabajo45. En un esfuerzo por determinar si estas especies comparten alguna vía común para la aptitud durante la BSI, se compararon primero los proteomas predichos de ambas especies. Las proteínas se consideraron homólogas entre C. freundii y S. marcescens si compartían ≥70% de identidad de aminoácidos en ≥50% de la secuencia. En total, se identificaron 42 proteínas homólogas como factores de aptitud significativos en ambos organismos (Tabla S1) con una serie de funciones diversas están representadas en esta lista de factores de aptitud compartidos. En particular, la proteína RuvA, cuya pérdida dio lugar a una disminución >10 veces en la aptitud de C. freundii por la infección de la competencia (Fig. 3A), se identificó junto con RuvC como factores de aptitud en S. marcescens. Estos resultados apoyan aún más la hipótesis de que la resolución de los complejos de unión Holliday, potencialmente durante la reparación recombinacional del daño en el ADN, es importante para la aptitud in vivo de estos organismos. La enzima fosfofructoquinasa PfkA también se identificó como un factor de aptitud en ambas especies. Al igual que en el caso de Citrobacter, la pfkA de S. marcescens es necesaria para la utilización de la glucosa como única fuente de carbono y, además, para la replicación bacteriana óptima en suero humano inactivado por calor45. En ambos organismos, la pfkA contribuyó a la aptitud en el bazo, tal y como se evaluó en el cribado de transposones, aunque, curiosamente, el mutante de S. marcescens pfkA también mostró una aptitud reducida en aproximadamente 9 veces en el riñón mediante la infección por competencia con la cepa de tipo salvaje. En el curso de este trabajo, se observó que la cepa de tipo salvaje de C. freundii UMH14 presentaba una colonización relativamente pobre del riñón en el modelo BSI, pero se ha demostrado que el gen pfkA de Proteus mirabilis contribuye a la aptitud en el riñón tras la infección del tracto urinario46. En conjunto, estos resultados demuestran la viabilidad de la identificación de estrategias de aptitud conservadas entre los organismos dentro de un entorno específico. Será necesario seguir trabajando para determinar si estos productos génicos también son necesarios en otros organismos causantes de BSI y si estas vías de aptitud conservadas pueden ser explotadas.