¿Cómo funciona la cromatografía de intercambio iónico?

La cromatografía de intercambio iónico (IEX) es una técnica que se utiliza habitualmente en la purificación de biomoléculas. Implica la separación de moléculas en función de su carga.

Esta técnica aprovecha la interacción entre las moléculas cargadas de una muestra y los elementos con carga opuesta de la fase estacionaria de la matriz cromatográfica. Este tipo de separación es difícil de realizar mediante otras técnicas, ya que la carga se manipula fácilmente mediante el pH del tampón utilizado.

Son posibles dos tipos de separación por intercambio iónico: intercambio de cationes e intercambio de aniones. En el intercambio aniónico la fase estacionaria está cargada positivamente mientras que en el intercambio catiónico está cargada negativamente.

Principio de la cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico se utiliza en la separación de biomoléculas cargadas. La muestra cruda que contiene moléculas cargadas se utiliza como fase líquida. Cuando pasa a través de la columna cromatográfica, las moléculas se unen a sitios de carga opuesta en la fase estacionaria.

Las moléculas separadas en función de su carga se eluyen utilizando una solución de fuerza iónica variable. Al hacer pasar dicha solución por la columna, se produce una separación altamente selectiva de las moléculas en función de sus diferentes cargas.

La técnica

Los pasos clave del procedimiento de cromatografía de intercambio iónico son los siguientes:

• Se carga una muestra de proteína impura en la columna de cromatografía de intercambio iónico a un pH determinado.
• Las proteínas cargadas se unirán a los grupos funcionales de carga opuesta de la resina
• Se utiliza un gradiente de sal para eluir las proteínas separadas. A bajas concentraciones de sal, se eluyen las proteínas que tienen pocos grupos cargados y, a mayores concentraciones de sal, se eluyen las proteínas con varios grupos cargados.
• Las proteínas no deseadas y las impurezas se eliminan lavando la columna.

También puede aplicarse un gradiente de pH para eluir proteínas individuales en función de su punto isoeléctrico (pI), es decir, el punto en el que los aminoácidos de una proteína tienen carga neutra y, por tanto, no migran en un campo eléctrico. Como los aminoácidos son compuestos iónicos zwitteros, contienen grupos con cargas positivas y negativas. En función del pH del entorno, las proteínas tienen una carga positiva, negativa o nula. En su punto isoeléctrico, no interactuarán con las partes cargadas de la resina de la columna y, por tanto, se eluirán. Se puede utilizar un gradiente de pH decreciente para eluir las proteínas utilizando una resina de intercambio aniónico y un gradiente de pH creciente para eluir las proteínas de las resinas de intercambio catiónico. Esto se debe a que el aumento del pH del tampón de la fase móvil hace que la proteína esté menos protonada (menos cargada positivamente), por lo que no puede formar una interacción iónica con la resina cargada negativamente, lo que permite su elución. Por el contrario, la disminución del pH de la fase móvil hará que la molécula se vuelva más protonada (menos cargada negativamente), permitiendo su elución.

Selección de la resina en la cromatografía de intercambio iónico

Las resinas de intercambio iónico tienen grupos funcionales cargados positiva o negativamente unidos covalentemente a una matriz sólida. Las matrices suelen ser de celulosa, poliestireno, agarosa y poliacrilamida. Algunos de los factores que afectan a la elección de la resina son el intercambiador de aniones o cationes, el caudal, el intercambiador de iones débil o fuerte, el tamaño de las partículas de la resina y la capacidad de unión. La estabilidad de la proteína de interés dicta la selección de un intercambiador de aniones o de cationes; puede utilizarse cualquiera de los intercambiadores si la estabilidad no es motivo de preocupación.

Las aplicaciones de la cromatografía de intercambio iónico

El intercambio iónico es el método cromatográfico más utilizado para la separación y purificación de biomoléculas cargadas, como polipéptidos, proteínas, polinucleótidos y ácidos nucleicos. Su amplia aplicabilidad, su gran capacidad y sencillez y su alta resolución son las razones fundamentales de su éxito como método de separación. La cromatografía de intercambio iónico se utiliza ampliamente en varias aplicaciones industriales, algunas de las cuales son las siguientes:

• Separación y purificación de componentes sanguíneos como albúmina, factores de crecimiento recombinantes y enzimas.
• Biotecnología – Aplicaciones analíticas como el control de calidad y la supervisión de procesos
• Investigación alimentaria y clínica – para estudiar las variedades de trigo y la correlación de la proteinuria con diferentes enfermedades renales.
• Fermentación – Las resinas de intercambio catiónico se utilizan para supervisar el proceso de fermentación durante la producción de ß-galactosidasa.

Lectura adicional

• Todo el contenido de cromatografía
• Descripción de la cromatografía
• Aplicaciones de la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)
• Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
• Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).Espectrometría de masas (LC-MS) Aplicaciones

Citaciones