ARNhc – Aplicaciones – Qué es el ARNhc, cómo funciona y sus aplicaciones.

¿Qué es el ARNhc y cómo se utiliza?

Las secuencias de ARN de horquilla corta (ARNhc) suelen estar codificadas en un vector de ADN que puede introducirse en las células a través de la transfección de plásmidos o la transducción viral. Un ARNhc de bucle troncal simple suele transcribirse bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa III (Pol III). El transcrito de 50-70 nucleótidos forma una estructura de bucle de tallo que consiste en una región de 19 a 29 pb de ARN de doble hebra (el tallo) unida a una región de ARN predominantemente de una sola hebra (el bucle) y un saliente dinucle de 3′. El ARNhc de bucle simple se transcribe en el núcleo y entra en la vía del ARNi de forma similar a un pre-micro-ARN. El ARNhc adaptado al microARN más largo (> 250 nucleótidos) es un diseño que se asemeja más a las moléculas nativas de pri-microARN, y consiste en una estructura de ARNhc que puede incluir desajustes similares a los de los microARNs, unida por un bucle y flanqueada por secuencias endógenas de microARN 5′ y 3′. El ARNhc adaptado al microARN, al igual que la horquilla de bucle simple, también se transcribe en el núcleo, pero se cree que entra antes en la vía del ARNi, de forma similar a un pri-microARN endógeno.

Las tecnologías de ARNhc están basadas en el ADN, lo que proporciona flexibilidad en el diseño del vector. La mayoría de los sistemas de ARNhc basados en vectores contienen un marcador seleccionable para permitir la eliminación de las células que no han sido transfectadas o transducidas con éxito, y el mantenimiento de las células con un knockdown génico sostenido. Los casetes de expresión de ARNhc también pueden incorporarse a sistemas de vectores virales, como retrovirus, virus adeno-asociados, adenovirus y lentivirus, que permiten una integración estable en el genoma del huésped y su expresión. Estas estrategias virales permiten la entrega de ARNhc a líneas celulares que son refractarias a la transfección. También se pueden incluir marcadores fluorescentes (como una proteína verde o roja fluorescente) para el seguimiento de las células que expresan ARNhc. El rendimiento del ARNhc está influenciado por muchos factores, entre ellos la eficiencia de la transducción o transfección, el promotor que impulsa la expresión del ARNhc y las modificaciones epigenéticas (que pueden llevar al silenciamiento de la expresión del ARNhc). Además, la influencia de cada uno de estos factores en el rendimiento del vector puede diferir según la línea celular o el tipo de célula. Las opciones de promotores y reporteros de SMARTchoice están disponibles para ayudar a los investigadores a seleccionar los promotores óptimos para la expresión del ARNhc y el silenciamiento del gen. Por último, cuando estos casetes de expresión de ARNhc se acoplan con promotores inducibles, como ocurre con el ARNhc lentiviral inducible SMARTvector o el sistema de vectores TRIPZ, los investigadores pueden diseñar estudios para modular temporal y espacialmente la expresión de los genes.

Vídeo de animación: La interferencia del ARN

¿Cómo se administra el ARNhc a una célula?

Hay dos opciones para la administración de ARNhc basado en ADN a las células. En el caso de los plásmidos, pueden emplearse los métodos típicos de transfección, como el uso de reactivos de transfección de lípidos o la electroporación. Las partículas lentivirales son una excelente opción para las células difíciles de transfectar, y en situaciones en las que se necesita una alta eficiencia o en las que se deben entregar múltiples construcciones por célula. La mayoría de los vectores modernos tienen marcadores seleccionables que permiten la eliminación selectiva de las células del cultivo que no han sido transfectadas o transducidas con éxito, de modo que puede desarrollarse un cultivo puro.

¿Qué afecta a la función y la especificidad del ARNhc?

La eliminación óptima de genes es un requisito para el éxito del ARNi utilizando sistemas de ARNhc. El diseño racional de las secuencias de ARNhc se ha basado en gran medida en algoritmos desarrollados con ARNsi. Aunque algunas reglas de diseño de ARNsi se aplican a los ARNhc, es probable que algoritmos de diseño de ARNhc más refinados mejoren el silenciamiento del gen diana para los ARNhc en el futuro. Para predecir las secuencias funcionales de ARNhc, el algoritmo de ARNhc SMARTvector™ de Dharmacon selecciona las secuencias diana en función de numerosos criterios, entre los que se incluyen las preferencias de nucleótidos dependientes de la posición, la estructura secundaria y los perfiles de estabilidad termodinámica específicos del andamiaje basado en el microARN SMARTvector. Además, el algoritmo del SMARTvector incluye varios criterios para aumentar la especificidad.

Al igual que en el caso de los siRNAs, pueden aplicarse enfoques bioinformáticos para crear shRNAs específicos de la diana al tiempo que se minimiza el potencial de efectos fuera de la diana. Se sabe que las altas concentraciones de intermedios de silenciamiento contribuyen a los eventos fuera del objetivo, pero el nivel de los intermedios es difícil de controlar cuando los ARNhc se expresan exógenamente. Varias publicaciones han documentado la evidencia de que, en condiciones específicas, los altos niveles de expresión de ARNhc de bucle de vástago simple pueden saturar la vía de ARNi endógena, y conducir a fenotipos no deseados . Otros estudios han sugerido que el uso de un ARNhc adaptado al microARN puede reducir la toxicidad celular para los experimentos de ARNi in vivo debido a que estos andamios son procesados más eficientemente tanto por Drosha-DGCR8 como por Dicer.

Las aplicaciones de ARNhc

el ARNhc ofrece la posibilidad de un silenciamiento génico prolongado. La transducción de ARNhc basado en virus permite acceder a células, como las primarias y las neuronales, que son difíciles de transfectar mediante estrategias tradicionales basadas en lípidos catiónicos. Los ARNhc basados en virus también se han utilizado para evaluar la función de los genes a escala de todo el genoma utilizando grupos de construcciones de silenciamiento. En la actualidad se utilizan ampliamente los grupos o matrices para realizar cribados de alto rendimiento con el fin de identificar los genes necesarios para una serie de procesos, como la supervivencia y proliferación de las células cancerosas, los componentes de la vía supresora de tumores, los moduladores del reloj circadiano de los mamíferos, los supresores de la transición epitelio-mesénquima, los mediadores de la replicación del VIH-1 y los reguladores de la migración celular. El poder del cribado de ARNi agrupado también se ha extendido al cribado de la función génica en modelos animales para investigar la biología in vivo.

¿Qué herramienta de ARNhc es la adecuada para sus necesidades?

Guía de selección de ARNhc

Ofrecemos una selección de reactivos y bibliotecas de ARNhc. Esta guía de selección rápida le ayudará a determinar la mejor opción para sus necesidades particulares.

Productos destacados

ARNhc – Productos

• Reactivos basados en vectores lentivirales para la interferencia de ARN.

SMARTvector Lentiviral ARNhc

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Bibliotecas lentivirales agrupadas

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Recursos destacados

ARNhc – Recursos

• Encuentre guías de productos, preguntas frecuentes y mucho más.

ArNhc lentiviral SMARTvector – Nota técnica

• Nota técnica que describe el flujo de trabajo experimental de ARNhc SMARTchoice en células en suspensión.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technical Manual

• La plataforma es un sistema innovador ideal para estudios mediados por RNAi.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Protocolos experimentales para el derribo de genes utilizando GIPZ lentiviral shRNA.

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