Deoxynukleotidtrifosfáty (dNTP) jsou základními stavebními kameny molekul nukleových kyselin a jako takové jsou nezbytnými složkami směsí PCR, protože bez nich by nemohla vzniknout nová (amplifikovaná) DNA. Čtyři jednotlivé deoxynukleotidy, které tvoří sekvenci DNA (tj. deoxyadenosintrifosfát, dATP; deoxythymidintrifosfát, dTTP; deoxycytosintrifosfát, dCTP; a deoxyguanosintrifosfát, dGTP) se obvykle přidávají do směsí PCR a RT-PCR v ekvimolárním množství, pokud však cílová sekvence DNA, která má být amplifikována PCR, obsahuje převážně dATP/dTTP (poměr AT) nebo převážně dGTP/dCTP (poměr GC), pak lze molární poměr dNTP přidaných do směsi PCR změnit, aby se zohlednila tato nerovnováha. dNTP se obvykle kupují buď jednotlivě, nebo jako (ekvimolární) směs od komerčních dodavatelů (např. Roche, Promega atd.) a jsou chemicky stabilní při skladování v mírně alkalických vodných roztocích při -20 °C. Je však třeba poznamenat, že dNTP jsou v roztoku přirozeně kyselé; proto může být nutné pracovní a zásobní roztoky před dlouhodobým skladováním neutralizovat alkalickými sloučeninami. Neutralizované roztoky dNTP se obvykle upravují na 10 mM zásobní roztoky pomocí spektrofotometrie nebo přidáním správného objemu sterilní vody k lyofilizovanému produktu přímo po jeho chemické syntéze. U některých PCR může být výhodné použití vysoce přečištěných dNTP „PCR-grade“ (Roche), které obsahují méně než 0,9 % deoxynukleotid difosfátů (dNDP), jsou >99 % čisté a neobsahují kontaminanty, jako jsou modifikované nukleotidy a tetrapyrofosfát. Tyto (dražší) vysoce čisté dNTP mohou být užitečné při úspěšné amplifikaci PCR DNA z preparátů obsahujících velmi nízký počet kopií cílové DNA.
V některých aplikacích a protokolech PCR může být jeden ze čtyř dNTP nahrazen analogickým dNTP, např. inosinem, 7-deaza-2′-deoxyguanosinem nebo modifikovaným dNTP, např. biotinem, fluoroforem nebo radioaktivně značeným dNTP. Takové modifikace umožňují provádět další následné post-PCR zpracování
.