Adenosin deamináza (ADA) je klíčovým enzymem purinových záchranných drah a její nedostatek způsobený mutacemi v genu ADA vede k jedné z nejčastějších příčin autozomálně recesivní těžké kombinované imunodeficience (SCID), která představuje přibližně 10-15 % případů v populacích mimo kmen. Chybějící nebo narušená funkce genu ADA vede k hromadění toxických metabolitů adenosinu, 2’deoxyadenosinu a deoxyadenosintrifosfátu (dATP). SCID s deficitem ADA je charakterizován těžkou lymfocytopenií postihující T- a B-lymfocyty a NK buňky, ale vzhledem k všudypřítomné povaze enzymu jsou pozorovány i neimunologické projevy, včetně neurodevelopmentálních deficitů, senzorineurální hluchoty a abnormalit skeletu. Výskyt deficitu ADA se v Evropě odhaduje na 1:375 000 až 1:660 000 živě narozených dětí. Včasná diagnóza SCID s deficitem ADA a zahájení léčby je u tohoto jinak fatálního onemocnění zásadní. Současné možnosti léčby zahrnují enzymovou substituční terapii (ERT), alogenní transplantaci krvetvorných kmenových buněk (HSCT) a autologní genovou terapii (GT).
Biochemie
ADA je všudypřítomně exprimovaný metabolický enzym, ačkoli úroveň enzymové aktivity se liší, přičemž nejvyšší hladiny jsou pozorovány v lymfoidních tkáních, zejména v brzlíku, mozku a gastrointestinálním traktu , a je exprimován jak intracelulárně, tak na povrchu buněk v komplexu s CD26 . Spolu s purinovou nukleosidfosforylasou tvoří základní složku purinové salvage dráhy, která je zodpovědná za ireverzibilní deaminaci adenosinu a 2’deoxyadenosinu na inosin, resp. 2’deoxyinosin. Chybějící nebo narušená funkce vede k intracelulární i extracelulární akumulaci těchto substrátů. Adenosin pochází především z rozkladu adenosintrifosfátu (ATP) a RNA a 2’deoxyadenosin z rozkladu DNA. 2’deoxyadenosin ireverzibilně inhibuje enzym S-adenosylhomocystein (SAH) hydrolázu, což způsobuje akumulaci SAH, který následně brání metylačním procesům zprostředkovaným S-adenosylmethioninem, jež jsou nezbytné pro normální diferenciaci thymocytů, a pravděpodobně přispívá k poruše vývoje T-lymfocytů, která je patrná při nedostatku ADA . Zvýšený intracelulární příjem 2’deoxyadenosinu následovaný fosforylací deoxycytidinkinázou vede k akumulaci deoxyadenosintrifosfátu (dATP), který inhibuje ribonukleotidreduktázu, což brání normální syntéze a opravě DNA . Adenosin je důležitou extracelulární signální molekulou; předpokládá se, že narušení těchto signálních drah narušuje normální imunitní reakce . Adenosinové receptory patří do rodiny receptorů spřažených s G proteinem, z nichž existují čtyři podtypy (A1, A2A, A2B a A3), které hrají různé role v regulaci normální buněčné fyziologie v celé řadě tkání včetně mozku, kardiovaskulárního systému a plic .
Diagnostika
Diagnostika deficitu ADA se stanovuje biochemickým a molekulárně genetickým vyšetřením. Biochemické vyšetření prokazuje chybějící nebo výrazně sníženou aktivitu ADA (< 1 % normálu) a výrazné zvýšení metabolitu dATP nebo celkového množství dAdo nukleotidů (součet dAMP, dADP a dATP) v erytrocytech. Charakteristická je také snížená aktivita SAH hydrolázy v erytrocytech (< 5 % normálu) . Pokud pacient s podezřením na deficit ADA v nedávné době podstoupil transfuzi krve, může být analýza aktivity ADA měřena u rodičů, přičemž snížená aktivita je pozorována u heterozygotních nosičů, nebo může být provedena na neerytroidních buňkách, jako jsou leukocyty. Lze také použít fibroblasty, ale kultury fibroblastů nejsou obvykle snadno dostupné, což může zpozdit diagnózu. Molekulárně genetická diagnostika se opírá o identifikaci bialelických patogenních mutací v genu ADA, který se nachází na chromozomu 20q12-q13.11 a v němž bylo identifikováno více než 70 kauzálních mutací.
Podpůrné laboratorní nálezy zahrnují lymfocytopenii s absencí T- a B-lymfocytů a NK-buněk a nízkou hladinu imunoglobulinů v séru, ačkoli v raném dětství může být IgG normální v důsledku maternoplacentárního přenosu. Proliferační reakce T-lymfocytů jsou nízké nebo chybí, stejně jako specifické protilátkové reakce. Bylo prokázáno, že hladina metabolických substrátů a genotyp korelují se závažností klinického fenotypu .
Klinické projevy
Imunitní systém – účinky na buněčné úrovni
Dominantní důsledky deficitu ADA jsou na imunitní systém, způsobují závažnou depleci T- a B-lymfocytů a NK buněk, což vede k poruše buněčné a humorální imunity. Vysoké hladiny ADA jsou exprimovány v lymfatických tkáních v důsledku vysoké úrovně buněčného obratu, zejména v brzlíku, což pravděpodobně vysvětluje výsledné závažné lymfocytotoxické účinky nedostatku . Základní mechanismy odpovědné za škodlivé účinky na imunitní systém byly objasněny pomocí experimentálních modelů s deficitem ADA. Dochází k výrazným účinkům na vývoj thymocytů, ačkoli není známo, v jaké fázi k tomu dochází. Apasov a spol. prokázali rozsáhlou apoptózu v thymu myších modelů s ADA(-/-), nikoli však v periferních lymfatických uzlinách a slezině, což dokazuje škodlivý vliv na vyvíjející se thymocyty. Apoptóza v thymi byla patrná převážně na kortiko-medulární junkci a postihovala zejména dvojitě pozitivní thymocyty. Periferní T-lymfocyty byly rovněž abnormální, s aberantní distribucí v sekundárních lymfoidních tkáních a expresí buněčných markerů, jakož i s defektní signalizací T-lymfocytů prostřednictvím TCR . Předpokládá se, že kombinace intracelulární akumulace toxických substrátů a defektní signalizace T-lymfocytů přispívá k depleci vyvíjejících se thymocytů.
Při deficitu ADA je postižen také kompartment B-lymfocytů, přičemž pacienti vykazují těžkou B-lymfocytopenii a hypogamaglobulinémii, ačkoli na rozdíl od T-lymfocytů se nezdá, že by byl narušen časný vývoj B-lymfocytů . Byla pozorována abnormální architektura slezinného germinálního centra, což naznačuje poruchu zrání B-lymfocytů v závislosti na antigenu, a B-lymfocyty rovněž vykazovaly snížené proliferační schopnosti, zvýšenou apoptózu a poruchu signalizace při aktivaci . To naznačuje, že defekt B-lymfocytů souvisí spíše s narušenou diferenciací v důsledku vnitřního defektu než pouze s nedostatkem vhodné pomoci CD4+ T-lymfocytů. Narušená V(D)J rekombinace v důsledku zvýšené hladiny dATP může také negativně ovlivnit diverzitu a funkci B-lymfocytů .
Imunitní systém – klinické projevy
V důsledku těžce defektní buněčné a humorální imunity se ADA-deficience typicky projevuje v časném životě těžkými infekcemi a neprospíváním a postižení jedinci obvykle bez intervence podlehnou během prvního nebo druhého roku života. Klinický obraz SCID s deficitem ADA je podobný ostatním genetickým formám SCID, charakteristické jsou přetrvávající průjmy, dermatitidy a závažné infekce, často způsobené oportunními patogeny, jako je Pneumocystis jiroveci. Fyzikální nálezy zahrnují absenci brzlíku na hrudním rentgenogramu a absenci lymfatických tkání.
Neimunologické projevy
Všudypřítomná povaha ADA také znamená, že důsledky nedostatku se neomezují pouze na lymfocyty a je pozorována i řada dalších systémových neimunologických projevů se známým dopadem na nervový, sluchový, kosterní, plicní, jaterní a ledvinový systém, jakož i kognitivní a behaviorální abnormality. Neimunologické projevy jsou v posledních letech stále zřetelnější s tím, jak se zlepšuje přežití a imunitní rekonstituce po transplantaci kmenových buněk, a povědomí o postižení více orgánových systémů a jeho identifikace jsou nezbytné pro včasné optimální řešení.
Děti s deficitem ADA vykazují řadu poruch chování, včetně poruch pozornosti, hyperaktivity, agrese a sociálních problémů, které se zřejmě vyvíjejí nezávisle na vlivech spojených s HSCT . Úroveň IQ je u dětí se SCID s deficitem ADA nižší ve srovnání s populačním průměrem a ve srovnání s dětmi s jinými formami SCID . Vysoké hladiny exprese ADA zjištěné v mozku a zjištění, že celkové skóre IQ koreluje s hladinou dATP při diagnóze , dále podporují teorii, že kognitivní porucha je jednak důsledkem metabolické poruchy při deficitu ADA, jednak závisí na stupni deficitu.
Bilaterální senzorineurální ztráta sluchu byla poprvé zaznamenána u dvou pacientů s deficitem ADA, kteří byli úspěšně léčeni HSCT. Strukturální a infekční příčiny byly vyloučeny a oba pacienti nedostali před HSCT žádnou kondicionaci, což ji vylučuje jako možnou příčinu a naznačuje základní metabolický defekt . V souboru 12 pacientů s deficitem ADA, kteří byli léčeni HSCT, byla zaznamenána vysoká prevalence oboustranné senzorineurální ztráty sluchu (58 %) . V této studii nebyl zjištěn žádný vztah mezi hluchotou a hladinou dATP.
Metabolická úloha adenosindeaminázy a důsledky akumulace toxických substrátů v plicích byly prokázány na experimentálních modelech, přičemž ADA(-/-)myši vykazovaly těžký plicní zánět s akumulací aktivovaných makrofágů a eosinofilů a remodelaci dýchacích cest, reverzibilní po zahájení ERT . Myší modely také ukázaly, že dlouhodobé vystavení vysokým koncentracím adenosinu v plicích v důsledku léčby nízkými dávkami ERT vede k rozvoji plicní fibrózy, ale tyto změny byly zvráceny po snížení hladin plicního adenosinu . U pacientů s deficitem ADA jsou pozorovány podobné plicní projevy a neinfekční plicní onemocnění, včetně pneumonitidy a plicní alveolární proteinózy (PAP), se vyskytuje častěji než u jiných genetických forem SCID . V jedné studii mělo 43,8 % pacientů s ADA-deficientním SCID PAP, která rychle ustoupila (u všech pacientů kromě jednoho) po zahájení ERT .
Hojně jsou hlášeny abnormality skeletu, například postihující kostochondrální klouby, které pravděpodobně souvisejí s nerovnováhou mezi ligandem nukleárního faktoru-κB (RANKL) a osteoprotegerinem (OPG), což narušuje interakci mezi osteoblasty a osteoklasty a následnou tvorbu kosti, ačkoli abnormality jsou většinou patrné pouze na radiologických snímcích bez dysmorfických následků . Vliv toxických metabolitů na kostní dřeň může hrát roli v „autokondicioningu“, který je patrný u SCID s deficitem ADA, s vytvářením nik kmenových buněk, což usnadňuje přihojení dárcovských hematopoetických kmenových buněk. Skeletální abnormality však byly zaznamenány i u jiných imunodeficiencí a úplná náprava po léčbě není pozorována, což naznačuje, že se na patogenezi podílejí i jiné faktory.
Zdá se, že postižení jater u ADA-deficience se u myší a lidí liší. Myší modely ADA(-/-) vykazují těžkou hepatocelulární degeneraci, která je fatální v perinatálním období . Oproti tomu u pacientů s deficitem ADA není obvykle pozorován těžký stupeň jaterního postižení, ačkoli existuje případ pacienta s deficitem ADA SCID, u něhož došlo k rychlému fatálnímu jaternímu selhání, které nebylo možné přičíst infekci , a případ novorozence s deficitem ADA SCID s hepatitidou a hyperbilirubinémií, která ustoupila po ERT . Zprávy o postižení ledvin při deficitu ADA zahrnují výskyt mezangiální sklerózy zjištěné u 7/8 pitev pacientů s deficitem ADA, přičemž u 6/8 byla rovněž prokázána kortikální skleróza nadledvin . Atypický hemolyticko-uremický syndrom byl hlášen u 4 pacientů s deficitem ADA, z nichž 2 se po podpůrné léčbě a zahájení ERT zotavili s mírným nebo žádným reziduálním postižením ledvin . Dermatofibrosarcoma protuberans je vzácný maligní kožní nádor, který se u pacientů s deficitem ADA vyskytuje častěji, ale mechanismus tohoto jevu je nejasný .
Přestože je deficit ADA obecně považován za systémovou metabolickou poruchu, je důležité vzít v úvahu, že některé systémové projevy byly hlášeny pouze u malého počtu pacientů. Mohou se na tom podílet i jiné faktory, například infekční agens, a je třeba dále zkoumat základní patogenezi těchto projevů. Nicméně povědomí o multiorgánovém postižení je nezbytné pro optimální péči o pacienty.
Částečný a pozdní nástup deficitu ADA
Ve fenotypu deficitu ADA existuje heterogenita, přičemž přibližně 15-20 % pacientů vykazuje „opožděný klinický nástup“, který se projevuje méně závažným, ale postupně se zhoršujícím kombinovaným imunodeficitem v pozdějším věku, obvykle během prvního desetiletí, ale příležitostně i v dospělosti . Klinické projevy u této skupiny s „opožděným nástupem“ zahrnují opakované, ale méně závažné infekce, zejména postihující sinopulmonální trakt. Vyskytují se také virové infekce papiloma virem . Může se také objevit autoimunita, alergie a zvýšená hladina IgE . Vzhledem k tomuto spektru klinických fenotypů je důležité zvážit diagnózu deficitu ADA u starších osob, protože opožděné rozpoznání vede ke zhoršení imunologických funkcí a rozvoji nevratných následků opakovaných a chronických infekcí. Při screeningu byli také identifikováni asymptomatičtí jedinci, kteří mají velmi nízkou nebo chybějící aktivitu ADA v erytrocytech, ale vyšší úroveň aktivity ADA (2-50 % normy) v jádrových buňkách, tzv. částečný deficit ADA . Tito pacienti mají zdánlivě normální imunitní funkce a očekávanou délku života, i když v současné době nejsou k dispozici údaje z dlouhodobého sledování, které by to potvrdily.
Léčba
Na rozdíl od jiných forem SCID zahrnuje léčba deficitu ADA více možností: ERT, alogenní HSCT a autologní GT, z nichž pouze poslední dvě jsou léčebné.
ERT s adenosin deaminázou konjugovanou s polyetylenglykolem (PEG-ADA) je jedinou terapeutickou možností, která není definitivní z hlediska korekce onemocnění, ale umožňuje systémovou clearance nebo „detoxikaci“ toxických metabolických substrátů. ERT je možností, pokud není k dispozici vhodný dárce HSCT nebo pokud existují kontraindikace HSCT, avšak dlouhodobá ERT je spojena se suboptimální imunitní rekonstitucí. Mezi další omezení ERT patří nedostupnost v některých zemích, vysoká cena a skutečnost, že je nutná celoživotní léčba. Je také krátkodobou možností, která se používá jako stabilizační můstek k HSCT nebo GT ke zlepšení endogenní imunitní funkce a pomoci při zotavení z infekcí nebo v případě plicní alveolární proteinózy k optimalizaci klinického stavu před definitivní léčbou. Použití ERT a načasování jejího ukončení před alogenní HSCT je třeba pečlivě zvážit, protože zlepšení imunity příjemce představuje potenciálně zvýšené riziko rejekce štěpu, ale ukončení ERT vystavuje pacienta výrazně zvýšenému riziku infekce. Je zajímavé, že Hassan a kol. neprokázali žádný rozdíl ve výsledcích přežití mezi pacienty, kteří dostávali a nedostávali ERT ≥ 3 měsíce před HSCT, ale většina skupiny, která dostávala ERT, pokračovala v transplantaci od shodného nepříbuzného dárce/neshodného nepříbuzného dárce (MUD/MMUD) nebo od haploidentického dárce . ERT může pokračovat po dobu jednoho měsíce po GT nebo až do doby infuze, aby se udržely nízké hladiny toxických metabolitů a usnadnilo se přihojení genově korigovaných buněk .
Tradičně byla HSCT léčbou volby u SCID s deficitem ADA, která se obvykle provádí co nejdříve po stanovení diagnózy, aby se minimalizovala doba vystavení vysokým hladinám toxických metabolitů a před získáním infekcí. V dosud nejrozsáhlejší studii zkoumající výsledky 106 pacientů s ADA-deficientním SCID po HSCT byla časnější HSCT spojena s lepším celkovým přežitím, které však nedosáhlo statistické významnosti, pravděpodobně v důsledku menšího počtu pacientů ve starších skupinách . Lepší celkové výsledky byly pozorovány po HSCT s použitím shodných sourozeneckých a rodinných dárců (MSD/MFD) ve srovnání s MUD a haploidentickými dárci (86 % a 81 % oproti 66 % a 43 %) . To může souviset s rychlejší dostupností sourozeneckých nebo rodinných dárců, což pravděpodobně vede k lepšímu klinickému stavu při HSCT. HSCT MSD a MFD se také obvykle provádí bez seroterapie, což má pozitivní dopad na míru obnovy T-lymfocytů a odstranění virových infekcí u těchto pacientů. Výsledky jsou také výrazně lepší u HSCT bez kondicionování ve srovnání s myeloablativním kondicionováním, ačkoli absence kondicionování může také zhoršit přihojení, zejména u haploidentických dárců. Nekondicionovaná HSCT s použitím MSD nebo MFD je spojena s úspěšnou buněčnou a humorální imunitní rekonstitucí, ačkoli dlouhodobé výsledky imunitního stavu nejsou známy a je nutné další sledování . To je v rozporu s jinými formami SCID a je možné, že lokální toxické účinky nedostatku ADA na dřeň působí jako „autokondicioning“ a umožňují přihojení dárcovských kmenových buněk bez chemoterapie. Zdá se, že pacienti, kteří přežijí HSCT, si vedou dobře, pokud jde o imunitní rekonstituci, bez ohledu na to, jaký typ dárce byl použit, přičemž většina pacientů dosáhne úplného buněčného a humorálního zotavení, je schopna reagovat na vakcíny a nevyžaduje náhradu imunoglobuliny. Naproti tomu pouze přibližně 50 % pacientů na dlouhodobé ERT je schopno ukončit substituční léčbu imunoglobuliny.
Méně než 25 % pacientů s ADA-deficitním SCID má k dispozici MSD nebo MFD a v takových situacích se GT prosadila jako akceptovaná terapeutická možnost. Po počátečním vývoji před více než 20 lety se GT pro ADA-deficientní SCID stala milníkem v pokroku medicíny jako první v Evropské unii (EU) licencovaný ex vivo retrovirový vektor kmenových buněk GT (Strimvelis™) . Původní přístupy před vývojem přípravku Strimvelis™ využívaly kostní dřeň nebo pupečníkovou krev bez přípravné úpravy, ale vedly k nedostatečné produkci ADA a pacienti vyžadovali trvalou ERT. Zdokonalení metod přenosu genů a zavedení nemyeloablativního kondicionování s nízkou dávkou busulfanu před infuzí, aby se vytvořil prostor pro transfekované buňky, vedlo k účinné imunitní rekonstituci a dosud nebyly hlášeny žádné případy genotoxické inzertní mutageneze , což je v rozporu s jinými primárními imunodeficity léčenými genovou terapií pomocí retrovirových vektorů. Dosud nejrozsáhlejší zpráva Cicalese a kol. o 18 pacientech s ADA-SCID léčených pomocí GT s mediánem sledování 6,9 roku uvádí 100% přežití bez leukemických transformací, sníženou míru infekcí a robustní rekonstituci T-lymfocytů a později B-lymfocytů, ačkoli procento genově korigovaných myeloidních buněk bylo mnohem nižší . Mezi výhody GT patří absence rizika onemocnění štěpu proti hostiteli a rychlejší zahájení léčby ve srovnání s léčbou spojenou s hledáním dárce, pokud není k dispozici MSD nebo MFD. Dlouhodobé výsledky však zatím nejsou známy a je nutné další sledování, které umožní lépe pochopit rizika spojená s GT ve srovnání s alogenní HSCT nebo dlouhodobou ERT. Ačkoli GT s použitím gama-retrovirálních vektorů dosud vykazovala vynikající bezpečnostní profil, byl nedávno oznámen nový vývoj s použitím GT zprostředkovaného lentivirovými vektory, který využívá potenciálu transdukovat nedělící se i dělící se buňky a který vykazuje slibné výsledky z hlediska klinické účinnosti i bezpečnosti .
Dlouhodobé výsledky
Transplantace pomocí MSD nebo MFD bez kondicionování časně po stanovení diagnózy je spojena s dobrými výsledky, pokud jde o přežití a obnovu CD3+ v prvním roce po HSCT , ale o dlouhodobých výsledcích a kvalitě imunitní rekonstituce pacientů s ADA-deficitním SCID je známo jen málo. Rozšířené použití novorozeneckého screeningu SCID může v budoucnu přispět k dalšímu zlepšení výsledků tím, že umožní identifikovat kojence s SCID (všech genetických příčin) před rozvojem infekcí a dalších komplikací pomocí detekce vylučovacích kruhů T-buněčných receptorů (TREC). TREC jsou kousky DNA vyříznuté během vývoje T-buněčného receptoru a jsou přesným měřítkem výstupu thymu. Pacienti s SCID mají výrazně snížený počet TRECs, které lze detekovat pomocí novorozenecké suché krevní skvrny . Časnější diagnóza a menší zátěž komplikacemi umožňuje rychlejší zásah a lepší výsledky, neboť studie ukazují, že sourozenci diagnostikovaní na základě známé rodinné anamnézy mají výrazně lepší přežití . Navzdory pozitivním vyhlídkám, pokud jde o imunitní rekonstituci po HSCT, jak uvádí Hassan et al., byla doba sledování v této studii maximálně 27,6 roku (medián 6,5 roku) , a k dalšímu hodnocení trvalosti T-lymfocytární imunity jsou zapotřebí údaje z delšího sledování, neboť první údaje naznačují, že tymopoéza je u nepodmíněných MFD/MSD HSCT omezená, což může vést k případnému vyčerpání repertoáru T-lymfocytů . Vyhlídky GT jako terapeutické možnosti jsou rovněž slibné; zejména s vývojem zdokonalených vektorů a technologie editace genů, ale je třeba dalšího dlouhodobého sledování. Vývoj probíhá také v oblasti zdokonalování PEG-ADA, přičemž probíhá klinická studie využívající rekombinantní zdroj enzymu jako alternativu k v současnosti používaným hovězím sekvencím . Ačkoli nebyly provedeny žádné rozsáhlé prospektivní studie zkoumající výsledky neimunologických defektů po definitivní léčbě, retrospektivní malé zprávy naznačují, že neurologické, behaviorální a audiologické defekty se neupravují. Je zapotřebí dalších studií, které by zkoumaly, zda faktory, jako je typ dárce a režim kondicionování nebo typ léčby, ovlivňují výsledky v těchto oblastech. Je také zapotřebí dále porozumět základní patogenezi, která se podílí na neimunitních systémových projevech, aby bylo možné optimální vyšetřování a léčba a také aby bylo možné plně rozlišit mezi metabolickými účinky nedostatku ADA a účinky způsobenými infekčními agens.
.