3.1 OMV’er: Sammensætning, biogenese og funktionelle roller
OMV’er er resistente og diskrete kugleformede sfæriske lipid-billedlagsnanostrukturer, der varierer mellem 10 og 300 nm i diameter, der stammer fra cellekuverten og er ude af stand til at replikere uafhængigt (Kulp og Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Fig. 4). Afløsning af OMV’er blev først observeret for mere end 50 år siden i transmissionselektronmikrografer, der skildrer ultrastrukturen af bakteriecellevæggen (Bladen og Waters, 1963; Bayer og Anderson, 1965; Chatterjee og Das, 1967). Det blev fastslået, at disse nanosfæriske strukturer bestod af en enkelt membran, der omgav et elektrontæt center (Work et al., 1966). Andre undersøgelser fra samme periode rapporterede også om tilstedeværelsen af “ekstracellulære kugler” i den cellefri supernatant af E. coli dyrket under næringsstofbegrænsende vækstbetingelser (Bishop og Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Derfor blev det oprindeligt postuleret, at dannelsen af OMV’er udelukkende fandt sted under stressende forhold. Ikke desto mindre viste yderligere undersøgelser klart, at OMV’er også kunne påvises under ikke-stressende forhold, både i laboratorie- og miljømæssige omgivelser (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). I dag er det kendt, at OMV’er bidrager til et utal af vigtige biologiske funktioner, og en af de første roller, der nogensinde er beskrevet for OMV’er, er deres involvering i patogenese, især som leveringsmidler for virulensfaktorer (gennemgået i Ellis og Kuehn, 2010). I årenes løb er OMV’er blevet tillagt yderligere funktioner, afhængigt af arten og kulturbetingelserne, herunder kommunikation inden for/imellem arter, reaktion på omslagsstress, tilegnelse af næringsstoffer, horisontal genoverførsel, ageren som “lokke”-agenter samt offentlige goder (for en detaljeret beskrivelse, se Kulp og Kuehn, 2010 og Schwechheimer og Kuehn, 2015). Generelt synes OMV’er at fremme bakteriens overlevelse inden for en specifik miljømæssig niche, hvilket fremhæver deres relevans for bakteriel homøostase.
Figur 4. Ydre membranvesikler fra gramnegative bakterier. (A) Repræsentation af en ydre membranvesikel (OMV-øverste panel) afledt af bakteriens cellehinde (nederste panel). Detaljer om den ydre membran (OM) og den indre membran (IM) er vist, herunder transmembranproteiner. Det periplasmatiske rum, hvori peptidoglykanlaget (PG) findes, viser opløselige periplasmatiske proteiner, fejlfoldede proteiner og nukleinsyrer. Indholdet af OMV illustrerer en del af de biomolekyler, der er blevet identificeret både på deres membran og lumen. (B og C) Transmissionselektronmikrografer af uranylacetat-negativ farvet Synechocystis sp. PCC 6803-celle, der frigiver en OMV (B, 120.000 × forstørrelse), og cellefrit koncentreret ekstracellulært medium af Synechocystis sp. PCC 6803, der viser flere OMV’er (C, 40.000 × forstørrelse).
(A)Baseret på Jan, A.T., 2017. Ydre membranvesikler (OMV’er) af gramnegative bakterier: en perspektivisk opdatering. Front. Microbiol. 8, 1053.
Numre undersøgelser har vist, at OMV’er er beriget med OM-komponenter, nemlig LPS og OMP’er, samt periplasmiske proteiner, PG-fragmenter og endda cytoplasmatiske og nukleinsyrer (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). Tidlige rapporter differentierede faktisk ikke MV’er, der er kunstigt dannet i opløsning (på grund af den naturlige lipidadfærd med omgruppering til vesikler, der vilkårligt indfanger materiale fra bakteriel lysis) fra intakte OMV’er. På det seneste har forbedrede isoleringsmetoder og avancerede omik-teknikker gjort det muligt at foretage en omhyggelig analyse af OMV’ernes sammensætning. Bemærkelsesværdigt nok er OMV’er faktisk beriget i specifikke cellulære komponenter, mens de er udtømt i andre (Lee et al., 2008), hvilket understøtter idéen om, at udvælgelse af lastindholdet ikke er en tilfældig proces. For eksempel varierede indholdet af Salmonella sp. OMV’er alt efter de testede vækstbetingelser: i OMV’er isoleret fra celler under næringsrige forhold blev cytosoliske proteiner involveret i translation og cellulær metabolisme fortrinsvis påvist, mens OMV’er under begrænsende næringsbetingelser var beriget med membranproteiner involveret i næringsstoftransport (Bai et al., 2014). Desuden viste en massespektrometri-baseret tilgang, at der ikke blev påvist nogen bredt bevaret specifik komponent i OMV’er (Schwechheimer et al., 2013), hvilket endnu en gang peger i retning af en variabel sammensætning. Alt i alt forventes det, at differentielle OMVs-sammensætninger både er relateret til stammeafhængige cellehindepartikker og forskellige økologiske nicher (Yoon, 2016).
Der er blevet foreslået tre mekanismer til dannelse af OMVs, der ikke gensidigt udelukker hinanden. I en model opstår vesikulering, når kovalente tværbindinger mellem membranproteiner og PG-laget brydes lokalt, enten ved et midlertidigt fald i den samlede abundans af tværbindinger eller ved en lokaliseret forskydning af tværbindinger, hvilket fremmer udbulingen af små OM-portioner. En anden model involverer periplasmiske nanoterritorier, hvor fejlfoldede proteiner og andre envelopekomponenter (LPS eller PG-fragmenter) ophobes. Efter denne unormale, begrænsede ophobning af cellulære komponenter falder integriteten af hinden lokalt, hvilket udløser udblødning af OM-portioner, der er fyldt med lumenalt indhold. Endelig er det også blevet foreslået, at særlige biofysiske egenskaber ved visse OM-lipider kan fremme vesikulation ved at sætte fokus på den specifikke integration af LPS eller fosfolipider, hvilket fører til ændringer i membranens fluiditet og fleksibilitet. Det antages også, at mange andre faktorer påvirker størrelsen, produktionshastigheden og sammensætningen af OMV’er, og hvis der findes en konsensus OMVs biogeneseproces, er den ikke helt karakteriseret (Kulp og Kuehn, 2010; Schwechheimer og Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
I cyanobakterieforskning er området OMV’er stadig ret nyt, og meget mangler stadig at blive udforsket. Dette illustreres især godt af det faktum, at den tidligste publikation udelukkende dedikeret til studiet af cyanobakterielle OMV’er stammer fra 2014 (Biller et al., 2014). I denne banebrydende undersøgelse vises det ikke kun, at laboratoriekontrollerede kulturer af den marine cyanobakterie Prochlorococcus kontinuerligt frigiver OMV’er, men også at disse vesikler kan findes i rigelige mængder i havvandsprøver. Desuden blev det påvist, at Prochlorococcus OMV’er var i stand til at understøtte væksten af heterotrofe bakteriekulturer, hvilket implicerer disse strukturer i de marine kulstofstrømme. Desuden blev der observeret interaktioner mellem marine fager-vesikler, hvilket viser OMV’ernes potentiale til at fungere som “lokkeagenter”. Samlet set illustrerede forfatterne nogle af de grundlæggende roller af OMV’er og deres utallige implikationer for mikrobielle økosystemer (Biller et al., 2014). I en nyere publikation blev OMV’er fra Prochlorococcus sammenlignet med dem fra tre andre marine heterotrofer i et forsøg på at afdække hyppigheden af DNA-pakning i vesikler og variationen blandt forskellige taxa (Biller et al., 2017). Ved at undersøge mængden og fordelingen af DNA, der er forbundet med OMV’er, blev det vist, at DNA er differentielt indkapslet inden for og mellem OMV-populationer. Mere afgørende tyder dette arbejde på, at den mekanisme, der pakker DNA ind i OMV’er, ikke fungerer ens i alle bakterier (Biller et al., 2017). Ud over Prochlorococcus og de marine Synechococcus-stammer er andre cyanobakterier også blevet vist at danne og frigive OMV’er, herunder den encellede Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) og Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), den filamentøse Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al, 2017) og den filamentøse, heterocystedannende Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) og Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Ud over de roller, der er beskrevet ovenfor for marine cyanobakterier afledte OMV’er (Biller et al., 2014), er der blevet foreslået andre funktioner for disse ekstracellulære vesikler. Cyanobakteriernes frigivelse af OMV’er kunne fungere som en effektiv sekretionsvej. En metabolisk manipuleret Synechococcus sp. PCC 7002-stamme, der mangler to glykogensyntase-gener, glgA-I og glgA-II, blev vist at frigive betydeligt flere OMV’er end wildtypestammen (Xu et al., 2013). Forfatterne stillede den hypotese, at da denne mutant blev observeret til at eksportere spontant opløseligt sukker til mediet, kunne de observerede OMV’er være relateret til denne sekretionsmekanisme, selv om sukkerindholdet i de observerede OMV’er ikke blev evalueret (Xu et al., 2013). Desuden blev det også påvist, at en Synechocystis sp. PCC 6803-stamme, der mangler TolC-homologen (essentiel for membranafhængige sekretionsmekanismer; se fig. 1 og 3), frigiver betydeligt flere OMV’er end den forældede stamme (Oliveira et al., 2016). Da TolC-knockout var stærkt nedsat i sekretionen af intracellulære proteiner, metabolitter og eksogene forbindelser, blev det foreslået, at hypervesikulering kunne opfylde behovet for sekretion. I overensstemmelse hermed er cyanobakterielle OMV’er også blevet foreslået til at transportere materiale, der er nødvendigt for biofilmudvikling. Dette blev foreslået efter observationer af cyanobiofont-afledte vesikler i sporokarpen af vand bregnen Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Da der angiveligt blev observeret genetisk materiale inde i disse vesikler, kunne de desuden være vektorer for lateral genoverførsel mellem cyanobionten og bregnen (Zheng et al., 2009). Cyanobakterielle OMV’er kan dog også fungere som en mekanisme til at afvikle envelope-stress: Gonçalves et al. karakteriserede et sæt af Synechocystis sp. PCC 6803-stammer, der mangler flere IM-translocase-komponenter, der er involveret i TolC-afhængige sekretionssystemer (Gonçalves et al., 2018). Interessant nok var tolC-knockout (den højeste OMV-producent i undersøgelsen) blandt de forskellige stammer, der præsenterede forskellige kapaciteter af OMV-frigivelse, den eneste, der viste bemærkelsesværdigt høje transkriptniveauer af spy og degQ, der koder for proteiner, der er involveret i envelope-stressreaktioner, og overekspression af Spy og DegP (Gonçalves et al., 2018). Således foreslog forfatterne, at sletning af tolC fremkalder envelope-stress, og at hypervesikulering i tolC-knockout repræsenterer en uafhængig mekanisme til at håndtere sådanne stressende forhold (Gonçalves et al., 2018).