Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) afkog er en traditionel kinesisk medicinformel. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge virkningen af XYS på kognitive evner og dens underliggende mekanisme hos ovariectomerede rotter. Sprague-Dawley-hunrotter blev ovariektomeret og behandlet med XYS (3 g/kg eller 9 g/kg) ved gavage, med subkutan injektion af 17-β østradiol (E2, 2 μg/kg) som en positiv lægemiddelkontrol og gavage af 1 ml saltvand (0,9 %) som placebokontrol. Efter 6 ugers behandling blev rotterne undersøgt ved hjælp af Morris water maze-test. Østradiolniveauet i serum og hippocampus blev målt ved hjælp af ELISA. Golgifarvning blev udført for at observere neuronal morfologi i hippocampus. Apoptose af hippocampale celler blev observeret ved TUNEL-farvning. Proteinindholdet af N-methyl-D-aspartatreceptor (NMDAR) 2A og 2B i hippocampus CA1-regionen blev bestemt ved Western Blot og immunohistokemi. Ekspression af østrogenreceptor (ER) og PI3K-signalering blev påvist ved hjælp af Western Blot. Sammenlignet med sham-gruppen var både indlæring og hukommelse forringet hos ovariectomerede rotter. Rotter behandlet med E2 eller højdosis XYS viste bedre indlæring og hukommelse sammenlignet med de saltvandsbehandlede rotter. XYS i høj dosis reducerede flugtlatenstiden signifikant i den rumlige erhvervelseprøve; i mellemtiden blev krydstiderne og varigheden i sondekvadranten øget i den rumlige prøveprøve. XYS i høj dosis fremmede de novo-syntesen af E2-indholdet i hippocampus, men havde ingen signifikant virkning på serum-E2-niveauet. Golgifarvning viste, at højdosis XYS kunne øge antallet af grene og tætheden af dendritiske pigge i hippocampus CA1-området. TUNEL-farvning viste, at højdosis XYS mindskede ovariektomi-induceret neuronal apoptose. Ekspressionsniveauet af NMDAR2A og NMDAR2B i hippocampal CA1 blev opreguleret af XYS-behandling. Den gavnlige virkning af XYS var gennem aktivering af ERα-PI3K-signalering. Konklusionen er, at højdosis XYS-behandling kan forbedre de kognitive evner hos ovariectomerede rotter ved at beskytte hippocampale neuroner og genoprette det hippocampale E2-niveau.
1. Introduktion
Perimenopausale kvinder lider ofte af angst og depression relateret til udsving i østrogenniveauet . Ud over angst og depression er glemsomhed en anden almindelig klage hos perimenopausale kvinder. Seattle Midlife Women’s Health Study rapporterede, at 60 % af kvinder i den midaldrende alder bemærkede en forringelse af hukommelsen . Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) fandt, at perimenopause var en afhængig risikofaktor for selvrapporteret glemsomhed hos midaldrende kvinder . Da hjernen er et vigtigt mål for østrogenregulering, spekuleres der i, at østrogenmangel kan være ansvarlig for den kognitive forringelse. Resultaterne fra observationsundersøgelser om indflydelsen på kognition er imidlertid ikke helt konsistente . Desuden er der endnu ikke fastlagt effektive terapeutiske hormoninterventioner til forbedring af kognitive præstationer . Desuden kan andre faktorer, som f.eks. opfattet stress, humør og fysisk helbred, også bidrage til hukommelsessymptomer . Østrogenproduktionen fra æggestokkene er mere tilbøjelig til at påvirke hukommelsen i tilfælde af pludselig nedgang snarere end naturlig overgang . I modsætning til inkonsekvensen i undersøgelser på mennesker støtter resultaterne i ovariectomerede dyr sammenhængen mellem østrogenmangel og kognitive ændringer og effektiviteten af hormonsubstitutionsbehandling .
Supplementering med phytoøstrogener er en populær alternativ behandling til at lindre symptomerne på overgangsalderen. Fytoøstrogener, såsom flavonoider, isoflavoner og lignaner, har en struktur, der ligner steroidale østrogener, og kan spille en østrogenlignende rolle ved at aktivere østrogenreceptorer (ER’er). En metaanalyse støttede effektiviteten af sojaisoflavontilskud med hensyn til at forbedre den visuelle hukommelse hos raske postmenopausale kvinder . SWAN Phytoestrogen Ancillary Study viste, at et højt indtag af isoflavon eller lignin kunne forbedre behandlingshastigheden eller den verbale hukommelse på et bestemt tidspunkt i overgangsalderen, selv om fordelen også var etnicitets-/race-relateret . Effekten af phytoøstrogener på forbedring af kognitionen er mere tydeligt angivet i dyreforsøg. Et hydroalkoholisk ekstrakt fra bukkehornsfrø kunne dæmpe ovariectomy- (OVX-) induceret hippocampal neuronskade og forbedre indlæring og hukommelsespræstationer i en rottemodel .
Xiao-Yao-San (XYS), som betyder glad og ubekymret pulver på kinesisk, er en traditionel kinesisk medicinformel (TCM), der bruges til behandling af angst og depression i overgangsalderen. Formlen består af Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizom macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe), og Glycyrrhizae radix (Gancao). En systematisk analyse, der omfattede 26 randomiserede forsøg, viste, at XYS var overlegen i forhold til antidepressiva, angivet ved scoringer på Hamiltons depressionsskala, og kunne forbedre antidepressiva i forhold til forbedring af scoringer på selvvurderende depressionsskala . Perimenopausale kvinder med exophthalmia og palpitation kunne også drage fordel af XYS-behandling . Nogle af XYS’ terapeutiske virkninger på lindring af menopausesyndromet kan tilskrives tilstedeværelsen af phytoøstrogener. I en række undersøgelser er der rapporteret om tilstedeværelsen af phytoøstrogener i XYS. Ergosterol er fundet i Poria cocos (Fuling) , og β-sitosterol er kendt for at være til stede i Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini et al. har udviklet et østrogen-chimerisk receptor/Gal4-responselement-reguleret/luciferase-reporter-assay til påvisning af tilstedeværelsen af phytoøstrogener i komplekse TCM-formler. De analyserede Bupleurum & Peony Formula, en modificeret formel af XYS med de samme hovedurter, og fandt et målbart indhold af phytoøstrogener .
Fytoøstrogenernes tilstedeværelse i XYS tyder på, at XYS har potentiale til at behandle kognitiv svækkelse forårsaget af østrogenmangel. En dyreundersøgelse viste, at XYS kunne dæmpe kronisk immobiliseringsstress (CIS) induceret indlæring og hukommelsesunderskud . På nuværende tidspunkt har ingen undersøgelse evalueret effekten af XYS på forbedring af kognitiv svækkelse hos perimenopausale kvinder. Derfor undersøgte den aktuelle undersøgelse virkningen af XYS på kognitive evner og dens underliggende mekanisme hos OVX rotter.
2. Materialer og metoder
2.1. Dyr og behandling
I alt 60 hun Sprague-Dawley rotter blev anvendt i denne undersøgelse. Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af Institutional Ethics Committee of Experimental Animal (godkendelsesnummer: ACU170802). Dyrene var opstaldet med fri adgang til vand og standardfoder under kontrolleret temperatur og luftfugtighed. Rotterne blev tilfældigt inddelt i 5 grupper (12 rotter/gruppe): sham-gruppe, OVX + saltvand eller O-saline-gruppe, OVX + 17-β østradiol (E2) eller O-E2-gruppe, OVX + XYS 9 g/kg eller O-XYS9-gruppe og OVX + XYS 3 g/kg eller O-XYS3-gruppe. Rotter gennemgik OVX-operation under anæstesi som beskrevet forinden . Kort fortalt blev der foretaget et langsgående snit i en tredjedel af stammen og 1-2 cm væk fra hver side af rygsøjlen. Fedtvævet blev forsigtigt trukket ud med en pincet. Æggestokkene blev identificeret, og livmoderhornene blev ligeret. Æggestokken blev fjernet, og det abdominale snit blev syet. I sham-gruppen blev der foretaget et snit i maven uden OVX.
Behandlingen blev indledt to uger efter OVX-operationen og varede i seks uger. Rotterne i XYS-behandlingsgrupperne fik XYS ved hjælp af en gnaveringsnål i en enkelt daglig dosis på 9 g/kg eller 3 g/kg. Subkutan injektion af E2 (2 μg/kg) blev indstillet som en positiv lægemiddelkontrol. Gavage af 1 ml saltvand (0,9 %) blev indstillet som placebokontrol. XYS-afkoget blev anvendt i form af et ekstrakt (1 g/ml, svarende til 1 g rå urter/ml), som blev stillet til rådighed af det tilknyttede hospital ved Nanjing University of Traditional Chinese Medicine (Nanjing University of Traditional Chinese Medicine). XYS decoction formlen blev rapporteret preciously . Den dosis af XYS, der anvendes i klinikken til perimenopausale kvinder, er 175 g rå urter/60 kg, hvilket svarer til 3,5 g/kg hos rotter. Med henvisning til andre eksperimentelle rapporter om rottemodellen satte vi den lave dosis til 3 g/kg og den høje dosis til 9 g/kg . E2-pulver (kat. nr. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev opløst i en lille mængde ethanol, og derefter blev der fremstillet 20 μg/ml lageropløsning med 0,9 % saltvand.
2.2. Morris Water Maze Test
Raternes indlærings- og hukommelsesfunktion blev vurderet ved hjælp af Morris Water Maze (MWM) test . MWM-forsøgsapparatet er et rundt bassin (200 cm i diameter) med 38-40 cm højt vand. Vandtemperaturen holdes konstant på 20-22 °C. MWW-testen består af tre dele, nemlig forsøget med rumlig erhvervelse (der varer 5 dage), forsøget med rumlig sonde og forsøget med synlig platform. I forsøget med rumlig erhvervelse blev rotterne forsigtigt anbragt i en tilfældig kvadrant af vandtanken med platformen skjult 1,5 cm i den nordøstlige kvadrant under vandet. Hver rotte fik lov til at svømme i op til 60 s for at finde platformen. Rotter, der ikke kunne finde platformen inden for 60 s, blev guidet til den, og latenstiden blev registreret som 60 s. Flugtlatenstiden blev registreret af et videoanalysesystem (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). Rotterne blev trænet 4 gange om dagen. Efter 5 dages træning fik rotterne et rumligt prøveforsøg med platformen fjernet fra den nordøstlige kvadrant. Rotterne blev placeret på samme startsted i den nordvestlige kvadrant. Rattens bevægelsesspor for at søge efter platformen i 120 s blev registreret. Varigheden og krydstiderne i målkvadranten blev beregnet for at vurdere fastholdelsen af den rumlige hukommelse. Næste dag efter prøven med den rumlige sonde fik rotterne prøven med den synlige platform svarende til træningen med den skjulte platform, hvor platformen blev hævet 1,5 cm over vandoverfladen og placeret i den sydvestlige kvadrant. Hver rotte blev frigivet 4 gange, og hver gang fra et andet indgangspunkt. Flugtlatens, svømmeafstand og svømmehastighed blev registreret.
2.3. Prøveudtagning
Efter afslutning af MWM-testen blev rotterne thorakotomeret og intuberet i den opstigende aorta via venstre ventrikel under bedøvelse med natriumpentobarbital (40 mg/kg via intraperitoneal injektion). Der blev opsamlet blod fra stammen ved hjælp af et serumseparatorrør til påvisning af E2. Hippocampi fra seks rotter blev adskilt fra hjernebarken og det omgivende hjernevæv, hurtigt fjernet, vasket med kold PBS og frosset ned i flydende nitrogen med henblik på påvisning af E2 og Western Blot. Tre uperfunderede hjernevæv blev immobiliseret i 4 % paraformaldehyd i 24 timer og anvendt til Golgi-farvning og immunohistokemi. De resterende tre rotter blev transkardialt perfunderet med kold saltvand efterfulgt af fiksering i 4% paraformaldehyd i 1 h. Hjerner blev derefter fjernet, fikseret i 4% paraformaldehyd i 24 h og indlejret i paraffin til TUNEL-farvning.
2.4. E2-detektion
Blodprøver fik lov til at koagulere ved stuetemperatur og blev centrifugeret i 15 min. ved 4 °C for at separere serum. Hippocampusvæv blev vejet, homogeniseret i kold saltvand og centrifugeret i 20 minutter for at opsamle supernatanten. E2-indholdet i serum og hippocampus-homogenat-supernatant blev påvist ved hjælp af ELISA-kit (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina).
2.5. Golgi-farvning
Hippocampus blev skåret i små blokke og behandlet til Golgi-farvning som beskrevet . Kort fortalt blev hippocampusblokkene nedsænket i Golgi-farvningsopløsning (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Kina) i 14 dage, hvor farvestofopløsningen blev udskiftet hver 2-3. dag. Vævene blev dehydreret med 30 % saccharose og skåret på 100 μm. Sektionerne blev behandlet med ethanoldehydrering, klaret med xylen og monteret på gelatinebelagte objektglas. Golgi-farvning blev udført med succes i alle prøver. Morfologien af neuroner i hippocampus blev observeret under lysmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan). Neuronerne i CA1-regionen i hippocampus blev analyseret ved hjælp af Neuron J, der blev tilsluttet i Image J-softwaren. Der blev udvalgt fem sektioner for hver rotte, og dendritiske pigge med komplet morfologi blev udvalgt for hver sektion . Tætheden og grenpunkterne af de dendritiske pigge blev målt.
2.6. Immunohistokemi
Ekspression af N-methyl-D-aspartatreceptor (NMDAR) underenheder 2A og 2B i hippocampus blev bestemt ved immunohistokemi i overensstemmelse med standardproceduren . De anvendte primære antistoffer var kanin anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Kina) og kanin anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Kina). Det sekundære antistof var HRP-konjugeret anti-kanin IgG (Servicebio).
2.7. TUNEL-farvning
De morfologiske ændringer i hippocampus blev påvist ved TUNEL-farvning med et kommercielt kit (Roche, Mannheim, Tyskland) som anvist. Sektionerne gennemgik DAB-kolorimetrisk reaktion efterfulgt af hæmatoxylinfarvning. Kernen af TUNEL-positive apoptotiske celler var brun under lysmikroskop. Der blev udvalgt fem sektioner for hver rotte, og der blev udvalgt tre ikke-repetitive felter (400x forstørrelse) for hver sektion. Procentdelen af TUNEL-positive celler i alle celler blev beregnet.
2,8. Western Blot
Den hippocampale CA1-hjernedel blev hurtigt udtaget og skåret i små sektioner i henhold til hjerneatlaset. Hippocampusvæv blev inkuberet natten over med RIPA-lysisbuffer (indeholdende 100 Mm PMSF, købt fra Servicebio). Celleaffaldet blev fjernet ved centrifugering i 10 minutter for at opsamle den proteinholdige supernatant. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af BCA-proteinanalysesættet (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinlysater (30 μg/lane) blev separeret ved 10 % SDS-PAGE og elektroplottet på PVDF-membran. Efter at være blevet blokeret med 5 % fedtfri mælk blev membranen undersøgt natten over med følgende primære antistoffer: kanin anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), kanin anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), kanin anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), kanin antiERα (1 : 2000, Millipore), kanin-anti-fospho-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), kanin-anti-fosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), kanin-anti-Bax (1 : 1000, Abcam), kanin-anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) og kanin-anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH blev påvist som intern kontrol. Derefter blev membranen undersøgt med sekundær peberrodsperoxidase- (HRP-) konjugeret gede-anti-kanin-IgG (1 : 5000, Bioworld) i 1,5 time. Båndene blev visualiseret ved hjælp af kemiluminescensmetoden. Den gennemsnitlige optiske tæthed af proteinbåndene blev kvantificeret ved hjælp af Image J-software.
2.9. Statistisk analyse
De eksperimentelle data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 5-software (San Diego, CA, USA). Numeriske data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Forskellen mellem to grupper blev sammenlignet ved t-test. Resultaterne af forsøg med skjult platform blev analyseret ved gruppe × dag gentagne foranstaltninger ANOVA efterfulgt af Tukey’s post hoc. Andre multiple sammenligninger blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey’s post hoc. værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
3. Resultater
3.1. Xiao-Yao-San afkog forbedrer rumlig indlæring og hukommelsesevner hos ovariectomerede rotter
Læringsevnen blev først vurderet ved hjælp af forsøg med rumlig erhvervelse. ANOVA med gentagne foranstaltninger viste, at både behandling og træningsdage påvirkede flugtlatencen (Figur 1(a)). Flugtlatensiteten i alle grupper faldt med stigningen i træningsdage (), og forskellen var også signifikant i tendensen til latensnedgang inden for hver gruppe (). Der var ingen interaktion mellem behandling og træningsdage (). I løbet af de to første træningsdage blev der ikke observeret nogen signifikant forskel i flugtlatencen i de enkelte grupper. Fra den tredje træningsdag var flugtlatencen signifikant længere end i skindgruppen; flugtlatencen i E2- og højdosis XYS9-gruppen var kortere end i saltvandsgruppen, men ikke forskellig fra den i skindgruppen. Efter 5 dages træning blev rotterne vurderet med sondeforsøg for at teste den rumlige hukommelse. Som vist i figur 1(b) var krydstiderne, varighedstiden og procentdelen af varighedstiden i sondekvadranten signifikant reduceret i saltvandsgruppen. Der blev ikke observeret nogen forskel i varighedstiden i de andre kvadranter. Behandling med XYS eller E2 kunne signifikant genoprette krydstiderne og varighedstiden i sondekvadranten til niveauet i sham-gruppen. For at udelukke virkningerne af miljøfaktorer og forsøgsdyrenes kognitive og aktivitetsniveauer på rumlig indlæring og hukommelse gennemgik rotterne også forsøget med den synlige platform (figur 1(c)). Der var ingen signifikant forskel i flugtlatenstid, svømmeafstand og svømmehastighed mellem grupperne. Samlet set tyder disse resultater på, at den rumlige indlæring og hukommelse var forringet hos OVX-rotter, og behandling med høj dosis XYS kunne effektivt forbedre de forringede kognitive funktioner.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.2. Xiao-Yao-San afkogning øger hippocampal østrogenindholdet i ovariectomerede rotter
Næst undersøgte vi effekten af XYS på østrogenniveauet i OVX rotter. Som vist i figur 2(a) forbedrede XYS-behandling ikke serumøstradiolniveauet, der var reduceret på grund af OVX; der var dog ingen signifikant forskel i serumøstradiolniveauet mellem sham- og OVX-behandlingsgrupperne. Det skal bemærkes, at højdosis XYS og E2 øgede hippocampal østradiolniveauet sammenlignet med saltopløsning (Figur 2(b)). O-XYS3-gruppen havde stadig lavere hippocampale østradiolniveauer end sham-gruppen. Ændringen af hippocampal E2-indholdet kan muligvis ikke forklares ved ændringen af det ændrede indhold af E2 fra gonaderne, men ved ændringen af in situ-syntesen. Derfor påviste vi ekspressionen af CYP19, det sidste enzym i østrogen-syntesen, i hippocampus. Resultaterne viste, at behandling med XYS eller E2 kunne øge ekspressionen af CYP19 sammenlignet med saltvandsgruppen (), men kun forskellen mellem højdosis XYS- og saltvandsgruppen var signifikant (). Behandlingen genoprettede ikke CYP19-niveauet til niveauet i skindgruppen. Resultaterne tyder på, at XYS fremmede ekspressionen af aromatase i hippocampus og dermed øgede de novo-syntesen af E2.
(a)
(b)
(c)
(d)
(d)
(a)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.3. Xiao-Yao-San afkog reducerer neuronal skade i hippocampus af ovariectomerede rotter
Celle morfologi i hippocampus, især i CA1-regionen, spiller en vigtig rolle i kognitiv evne . Cellemorfologien i hippocampus blev analyseret ved Golgi-farvning, som vist i figur 3(a). Sammenlignet med sham-gruppen faldt antallet af neuroner i saltvandsgruppen betydeligt, og morfologien af dendritiske pigge blev beskadiget. Yderligere analyse af CA1-neuroner viste, at punktantallet af neuroner og tætheden af dendritiske rygsøjler faldt betydeligt i saltvandsgruppen (figur 3(b) og 3(c)). Højdosis XYS-behandling øgede neuronantallet i hippocampus og øgede punktantallet af neuroner og pignetætheden i CA1-regionen. E2-behandling havde den samme terapeutiske virkning som højdosis XYS. Lavdosis XYS forbedrede imidlertid ikke effektivt neuronale skader i hippocampus CA1-regionen. På samme måde blev apoptosen af hippocampale (CA1, CA3, DG) neuroner reduceret ved højdosis XYS- eller E2-behandling (figur 4). Lav dosis XYS kunne imidlertid kun reducere apoptosen af CA3-neuroner, men havde ingen virkning på CA1- og DG-neuroner. Samlet set kunne højdosis XYS reducere neuronalskaderne i hippocampus, især i CA1-regionen.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Xiao-Yao-San afkog øger hippocampal ekspression af NMDAR2A og NMDAR2B hos ovariectomerede rotter.
Synaptisk plasticitet er det neurobiologiske grundlag for langtidsindlæring og hukommelse, og præstationen i MWM-testen påvirkes af NMDAR-funktionen . Derfor vurderede vi yderligere ekspressionen af NMDAR-underenhederne 2A og 2B i hippocampal CA1. Western blot (figur 5(a) og 5(b)) viste, at ekspressionen af NMDAR2A og NMDAR2B var reduceret hos OVX rotter. Behandling med XYS eller E2 øgede ekspressionsniveauet af disse to proteiner signifikant til det samme niveau som i sham-gruppen. Immunohistokemi (Figur 5(c)) viste også, at andelen af positivt farvede celler steg i behandlingsgrupperne. Sammenlignet med saltvandsgruppen øgede højdosis XYS ekspressionen af både NMDAR2A og NDMAR2B signifikant ( og 0,013, hhv.), men lavdosis XYS kunne kun øge ekspressionen af NMDAR2A signifikant ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.4. Xiao-Yao-San afkog aktiverer PI3K-signalvej gennem ERα
Effekten af E2 eller phytoøstrogener på fysiologi medieres af ER-signalering. Undersøgelser har vist, at aktivering af ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK), en mitogen-aktiveret proteinkinase, er nødvendig for de gavnlige virkninger af E2 på hukommelsen . Fosforyleringen af ERK1/2 er afhængig af aktiveringen af PI3K . Derfor undersøgte vi virkningen af XYS på ER-PI3K-signalering . Som vist i figur 6 fremmede højdosis XYS og E2 ekspressionen af ERα, fosforyleret ERα (Ser118) og PI3K p110β (den katalytiske underenhed) signifikant sammenlignet med saltvandsgruppen. Aktivering af ERα-PI3K reducerede yderligere ekspressionen af den proapoptotiske faktor Bax og øgede ekspressionen af den antiapoptotiske faktor Bcl-2. Lavdosis XYS havde imidlertid ikke signifikant indflydelse på ERα-PI3K-signalering, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne i figur 3 og 4.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Diskussion
XYS har længe været anvendt til behandling af perimenopausal angst og depression. Vores undersøgelse udforskede den nye anvendelse af XYS i behandlingen af OVX-induceret kognitiv svækkelse. Resultaterne viste, at XYS effektivt forbedrede rumlig indlæring og rumlig hukommelse hos OVX-rotter. Den mulige mekanisme er, at XYS fremmer de novo-syntesen af østrogen i hippocampus og dermed aktiverer ERα-PI3K-signalvejen og hæmmer apoptosen af hippocampusneuroner.
Den underliggende mekanisme for XYS til behandling af depression er blevet undersøgt i vid udstrækning. XYS spiller en antidepressiv rolle ved at regulere et omfattende netværk, der involverer neurotransmittere, neurotrofiner, hypothalamisk-hypofyse-bidrenalakse, aminosyrer og lipider . Nogle af disse undersøgelser har vist, at XYS kan virke på ændringer i hjernen i forbindelse med stress. In vitro-undersøgelser viste, at et XYS-holdigt serum kunne vende ændringen i mitokondriemembranpotentialet, koncentrationen af frit calcium og apoptotisk hastighed af neuroner induceret af oxidativ stress . Vores undersøgelse viste, at XYS også mindskede neuronal apoptose i hippocampusregionen hos OVX-rotter. De antiapoptotiske virkninger af XYS tyder på, at det havde potentiale til at virke på en række patologiske processer relateret til neuronal apoptose i hjernen.
Resultaterne af vores undersøgelse viste, at XYS kunne genoprette østrogenniveauet i hippocampus hos OVX rotter. Hippocampus er afgørende for hukommelsesdannelse og er rig på ER’er, og østrogen fremmer højere kognitiv og synaptisk sundhed via disse ER’er . Flere kliniske forsøg viste effektiviteten af hormonerstatningsterapi på kognitive symptomer i forbindelse med østrogentab hos kvinder . XYS kunne øge østradiolniveauet i hippocampus, hvilket skulle være det afgørende grundlag for dets effektivitet med hensyn til at forbedre de kognitive evner hos OVX-rotter. XYS øgede imidlertid ikke serumøstradiolniveauet. Dette kan skyldes, at østradiol kan syntetiseres de novo i hippocampus, mens serumøstradiol stammer fra gonaderne . Vores resultater viste, at XYS øgede ekspressionen af CYP19 i hippocampus, hvilket tyder på, at det øgede E2 i hjernen sandsynligvis stammer fra hippocampus . Resultaterne af vores undersøgelse viste, at XYS opregulerede ekspressionen af NMDAR2A og NMDAR2B i hippocampus hos OVX-rotter . Dette resultat var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. Østrogen blev fundet for at øge både dendritisk spindeltæthed og synapseantal i hippocampus gennem modulering af NMDAR-funktioner i OVX-rotter . Østrogen kunne også genoprette hippocampal neuronmorfologi i ældre rotter ved at genoprette NMDAR2B-niveauet til det niveau, der ses i unge niveau i CA1-regionen; hvad mere er, kan østrogen påvirke mobiliteten af NMDAR2A og NMDAR2B på tværs af synapsen . Aktivering af NMDAR kunne til gengæld bidrage til syntesen af hippocampal E2 ved at inducere Ca2+ influx .
Ud over NMDAR’er kan XYS regulere ekspressionen af andre kognitionsrelaterede faktorer i hjernen. Tab af postsynaptisk tæthedsprotein 95 (PSD-95), synaptophysin og hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) i hippocampus er blevet direkte korreleret med indlærings- og hukommelsesunderskud . Virkningen af XYS hos CIS-rotter er blevet relateret til fremme af ekspressionen af PSD-95 og synaptophysin i hippocampus . XYS har også vist sig at opregulere BDNF i frontalcortex, hippocampal CA1-regionen og amygdalaen hos CIS-rotter . Under CIS-behandlingsprocessen af XYS blev c-Jun N-terminal kinase (JNK) signalvejen hæmmet i hippocampus .
Selv om vi ikke specifikt har undersøgt, hvilken komponent der er den vigtigste aktive af XYS på læring og hukommelse, tyder vores resultater på, at hovedkilden til phytoøstrogener i XYS er en kandidat, der er værd at undersøge yderligere. Forskningen af antidepressivt middel kan også give os nogle spor. Jiali Liu et al. opdagede, at Bupleuri radix (Chaihu) er det vigtigste antidepressive lægemiddel i XYS-receptet baseret på den serumfarmakokemiske analyse af petroleumsetherfraktionen . In vitro-undersøgelse viste, at Bupleuri radix-ekstrakt fremmede proliferation af neuroblastomceller gennem aktivering af PI3K/AKt-vejen . Aktivering af PI3K blev også observeret i vores undersøgelse. .
Aktuelle kliniske rapporter viser, at XYS har en betydelig antidepressiv terapeutisk virkning, men der er ingen klar toksikologisk undersøgelse af XYS’ toksicitet og bivirkninger i detaljer. Generelt set kan XYS betragtes som en receptpligtig medicin uden for mange bivirkninger. XYS har flere modificerede opskrifter, hvis grundingredienser er de samme som i XYS. En nyere metaanalyse har vurderet effektiviteten og sikkerheden af modificeret XYS til behandling af perimenopausalt syndrom. De samlede resultater tyder på, at modificeret XYS kan være mere effektivt og mere sikkert til behandling af perimenopausalt syndrom sammenlignet med hormonerstatningsterapi . På grund af den dårlige metodologi i de inkluderede undersøgelser er det dog nødvendigt med mere grundige forsøg for at bekræfte XYS’s effektivitet og sikkerhed. Ved hjælp af 1H-kernemagnetisk resonans (NMR) rapporterede Xiaoxia Gaos forskningsgruppe, at petroleumsetherfraktionen, der indeholder lipofile komponenter, var den mest effektive fraktion til behandling af depression . De rapporterede også, at Bupleuri Radix, den vigtigste antidepressive komponent, kunne producere flere toksiske virkninger i leveren eller nyrerne hos raske rotter end hos rotter med kronisk uforudsigelig mild stress. De toksiske virkninger var forbundet med øget galdesyrekoncentration, lettelse af lysin nedbrydning og metabolisk forstyrrelse af sfingolipid, glycerophospholipid og fedtsyrer . Dette resultat blev bekræftet i en nyere metabolomisk undersøgelse af patienter med depression. XYS spillede en antidepressiv rolle ved at regulere syntesen af leucin, valin og isoleucin og metabolismen af binærsyre, fedtsyre, argin og prolin . Disse undersøgelser tyder på, at det er nødvendigt at overvåge patientens status nøje med rettidig justering af lægemiddeldosis for at forhindre toksiske bivirkninger.
5. Konklusioner
I denne undersøgelse viste vi, at højdosis XYS-behandling havde samme effektivitet som E2 med hensyn til at forbedre de kognitive evner hos OVX-rotter. Den terapeutiske virkning blev medieret ved at beskytte hippocampale neuroner og genoprette det hippocampale E2-niveau. ERα-PI3K-signalvejen var involveret i processen. Vores undersøgelse tyder på, at XYS kunne være en mulighed for behandling af perimenopausal kognitiv svækkelse. I øjeblikket anvendes XYS hovedsagelig til behandling af klinisk angst og depression. Der er behov for flere kliniske data for at verificere dets effekt på forbedring af kognitiv funktion.
Datatilgængelighed
De data, der anvendes til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra de tilsvarende forfattere efter anmodning.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen form for interessekonflikter.
Autors bidrag
Lina Liu og Fei Ge bidrog ligeligt til denne forskning.
Akkreditering
Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795 og 81903974); Jiangsu-provinsens naturvidenskabelige fond for naturvidenskab (bevilling nr. BK20181235); Jiangsu-provinsens kontor for traditionel kinesisk medicin (bevilling nr. YB2017066); Nanjing Science and Technology Development Plan Project (bevilling nr. 201715072); projektet for Jiangsu-provinsens hospital for kinesisk medicin (tilskud nr. Y2018CX09); og et projekt finansieret af det prioriterede akademiske program for udvikling af Jiangsu højere uddannelsesinstitutioner.