I denne undersøgelse antog vi, at forskellige metoder til RNA-isolering vil påvirke resultaterne ved analyse af genekspression i væv. RNA-ekstraktionsmetoder kan generelt karakteriseres som enten phenol:chloroform-ekstraktion efterfulgt af alkoholudfældning (TRIzol), phenol:chloroform efterfulgt af ekstraktion i fast fase (kolonnebaseret; miRVana og miRNeasy) og separation i fast fase med/uden affinitetsharpiks (Norgen total og Isolate II). Disse metoder er primært udviklet til ekstraktion af lange mRNA’er og er baseret på den antagelse, at alle RNA’er renses lige meget. Desuden er der en række overvejelser i forbindelse med valget af en bestemt RNA-ekstraktionsmetode, f.eks. kvalitet, kvantitet, pris og brugervenlighed (tid til ekstraktion). Heri præsenterer vi data, der viser, at den metode, der anvendes til ekstraktion af RNA, også vil give variable resultater sammenlignet med forskellige metoder i downstream-applikationer og derfor er en anden vigtig overvejelse.
Denne undersøgelse viser, at RNA-isoleringsmetoder varierer med hensyn til kvantitet og kvalitet af RNA-prøver og i analysen af miRNA- og målgenekspression. Vi valgte organer, der kan være vanskelige at isolere RNA fra af forskellige årsager. For eksempel er RNA-isolering fra hjerne ofte bemærket at resultere i lave udbytter på grund af dens høje lipidindhold. Dette var særligt tydeligt med Bioline Isolate II-sættet. Ifølge producentens protokol skal der oprenses op til 5 μg RNA fra 10 mg hjerne fra rotter/mus. Ifølge miRNeasy-håndbogen kan der imidlertid opnås 5-20 μg RNA fra hjerne med den samme mængde inputmateriale. Problemløsning på producentens websted beskriver et problem med lipidrige væv, nemlig tilstopning af kolonnen, og foreslår, at man mindsker prøvens mængde eller øger mængden af lysisbuffer. Vores ekstraktioner blev udført inden for de foreslåede grænser i protokollen. Derefter foreslår de at udføre præekstraktion ved hjælp af TRIsure-reagens (Biolines ækvivalent til TRIzol) og derefter kolonnebaseret separation med sættet for at rense den vandige fase op. Denne metode ville så være sammenlignelig med miRVana- og miRNeasy RNA-ekstraktionsmetoderne og kan resultere i et bedre udbytte for dette væv. Desuden er RNA-kvaliteten korreleret med vævsspecifikke reaktioner på fysiologisk stress både før og efter vævsdød. Væv som f.eks. lunge og lever har typisk lave RIN’er og en lille 28S-top, da disse væv er udsat for hurtigere nedbrydning af RNA af høje niveauer af nukleaser. For at inaktivere nukleaser fryses vævet hurtigt ned, og optøning forhindres, indtil det afvejede materiale tilsættes til ekstraktionsbufferen. Selv om optøning af vævet blev forhindret, kan vi ikke udelukke, at tiden fra eutanasi af dyret og udtagning af organerne til hurtig nedfrysning er en medvirkende faktor til de generelt lave RIN-værdier og nogle nedbrydningsprodukter, der er observeret for alle lungeprøver, uanset hvilket isoleringssæt der er anvendt. En alternativ metode til inaktivering af nukleaser er anvendelse af en RNA-stabiliserende opløsning som f.eks. RNAlater (ThermoFisher Scientific), som gør det muligt at behandle ufrosne vævsprøver senere. Det kan hjælpe med at sikre RNA’s integritet, men det er ikke kompatibelt med alle RNA-isoleringsprocedurer, og brugerne bør kontrollere deres specifikke metode, inden de udfører ekstraktioner. Tilføjelsen af en top efter 60 s i nogle prøver i Bioanalyser-analysen tyder på gDNA-kontaminering. Der kan udføres en yderligere DNase-behandling på kolonnerne med nogle kits, men det anbefales kraftigt at foretage en gDNA-eliminering under det omvendte transskriptionstrin. Medtagelsen af dette trin i vores metoder kan forklare, hvorfor der ikke var nogen interferens ved analysen af mRNA-ekspressionen af Norgen-lungeprøverne, men det påvirkede miRNA-ekspressionsanalysen, da Taqman miRNA-assayprotokollen ikke omfatter gDNA-fjernelse. Endvidere er RNA-prøvernes renhed en kritisk faktor, da selv om prøver med RIN > 7 bør fungere okay i de fleste downstream-applikationer, kan prøver, der involverer enzymatiske reaktioner såsom qPCR, blive hæmmet af nukleaser, metalioner eller organiske forureninger. Generelt havde Bioline Isolate II RNA-prøverne et lavere 260/230-forhold, og forurenende stoffer kan være medvirkende til den dårlige præstation. Endelig blev der observeret forskelle i berigelsen for miRNA’er i det samlede RNA-præparat. Da miRNA’er udgør en lille del af det samlede RNA-repertoire, kan det være vanskeligt at bestemme deres bidrag ud fra integritetsanalysen. Qubit microRNA-assayet giver en meget selektiv påvisning af små mængder af små RNA’er, selv i tilstedeværelsen af almindelige forurenende stoffer. Der blev almindeligvis påvist høje procentdele af miRNA’er med miRVana- og Norgen-ekstraktionsmetoderne, men i betragtning af integritetsanalysen for Norgen-total-RNA-præparater er det muligt, at miRNA-berigelsen kan være overvurderet, da mindre RNA-fragmenter påvises efter nedbrydning eller oxidation af større RNA’er (mRNA’er, rRNA’er eller tRNA’er) eller i tilfælde af lungeprøverne DNA-kontaminering, der forstyrrer Qubit-resultaterne. Derfor er mængden, kvaliteten og renheden af RNA-prøverne meget vigtige faktorer for valget af en bestemt RNA-ekstraktionsmetode, og yderligere forskning i, hvordan man optimerer disse metoder til det pågældende væv, kan bidrage til at forbedre disse.
Profilering af miRNA’er kan give indsigt som biomarkører til diagnostiske eller prognostiske anvendelser. For eksempel kan paneler af miRNA’er bruges til at klassificere forskellige kræftfænotyper, forudsige tilbagefald eller respons på terapier . Med henblik på opdagelse og klinisk anvendelse af miRNA-baserede biomarkører er der imidlertid behov for optimeret og standardiseret praksis for, hvordan RNA’et ekstraheres, for at undgå modstridende resultater. F.eks. fandt en metaanalyse af 63 offentliggjorte undersøgelser foretaget af Zhou et al. (2014) inkonsistente og endog modstridende resultater ved vurderingen af den prognostiske værdi af oncomiR, miR-21 . Forfatterne tilskriver heterogeniteten forskelle i prøvernes kilde, detektionsmetoderne og normaliseringsmetoderne, men hentydede ikke til metoderne til ekstraktion af RNA, som vi viser også bidrager.
De biologiske funktioner og mål for meget få miRNA’er er blevet eksperimentelt valideret, men dette er afgørende for at realisere potentialet i miRNA-baseret terapi. Desuden vil afdækning af vævsspecifikke biologiske funktioner hjælpe med at identificere deres terapeutiske virkning og potentielle off-target-effekter i normale væv. Validering af miRNA-mRNA-interaktioner udføres primært i cellekulturforsøg, som indebærer kunstig manipulation af endogene miRNA’er. De niveauer, der opnås ved hjælp af cellekulturmanipulation (f.eks. transfektion af mimiske stoffer), svarer imidlertid normalt ikke til de fysiologiske niveauer, der observeres in vivo, og derfor er det vigtigt at rekapitulere resultaterne i passende dyremodeller. På nuværende tidspunkt er der ingen rapporter, der direkte har sammenlignet miRNA- og målgendetektion fra totale RNA-prøver ved hjælp af forskellige ekstraktionsmetoder. Vi viser, at RNA-ekstraktionsmetoderne er forskellige i deres effektivitet med hensyn til at isolere både korte og lange RNA’er, og derfor skal man nøje overveje at vælge en passende metode, hvis man ønsker at detektere begge dele fra den samme prøve.
Tidligere forskning har almindeligvis antaget, at alle former for RNA renses lige meget. Der er imidlertid fremkommet flere rapporter, der viser forskelle i ekstraktionseffektivitet afhængigt af den metode, der anvendes til RNA-isolering. Kim et al. (2011) trak deres artikel i Molecular Cell tilbage, da de fandt, at deres konklusioner om forskelle i miRNA-ekspression fra celler dyrket ved forskellige konfluenser (høj tæthed versus lav tæthed), og når de blev løsnet fra kulturskålen (adhærent versus suspension) faktisk blev forklaret ved forskelle i RNA-ekstraktionseffektivitet ved hjælp af TRIzol-metoden . De fandt, at miRNA’er med lavt GC-indhold og stabil sekundærstruktur gik tabt under ekstraktionen, snarere end at blive nedbrudt i cellerne, som de oprindeligt havde offentliggjort . Tidligere resultater fra El-Khoury et al. (2016) fandt forskelle i miRNA-genopretning fra celler, plasma og urin/plasma-afledte exosomer ved sammenligning af TRIzol LS, miRNeasy serum/plasma og miRCURY biofluid ekstraktionskits . Forfatterne fandt, at miRCURY-sættet isolerede meget rent RNA, men dårligt genvundet miRNA’er, TRIzol gav RNA af lav renhed, hvilket påvirkede PCR-effektiviteten, mens miRNeasy gav RNA af dårlig kvalitet, men fungerede bedst til miRNA-detektion. Ligeledes fandt McAlexander et al. (2013) forskelle i miRNA-ekstraktion fra plasma og cerebrospinalvæske . De sammenlignede miRVana, miRCURY Cell and Plant kit og TRIzol LS ekstraktioner med og uden glykogen som bærestof. miRVana var ens med eller uden glykogen, mens miRCURY uden glykogen havde en lidt lavere miRNA-genvinding end miRVana. Glykogen forbedrede dog i høj grad miRNA-genvindingen med miRCURY-sættet, men forværrede det lave udbytte og variabiliteten med TRIzol-ekstraktion. De fortsatte derefter med at sammenligne miRCURY Cell and Plant kit med miRCURY Biofluids og miRNeasy serum/plasma ekstraktionsmetoder med glykogen som bærer og fandt, at miRCURY Biofluids havde den højeste relative abundans af spiked-in exogent miRNA og konkluderede, at dette var den overlegne metode til deres særlige anvendelse. Samlet set fremhæver disse undersøgelser forskellene i RNA-genoprettelse ved hjælp af forskellige ekstraktionsmetoder og antyder behovet for at optimere for din celle, dit væv og/eller din væske af interesse.
Der er flere trin under arbejdsgangen, der kan indføre eksperimentel variation. Begyndende med metoden til fiksering eller nedfrysning af vævet, opbevaring af materialet, RNA-ekstraktionsmetoden, den metode, der anvendes til omvendt transskription og qPCR-amplifikation eller andre downstream-platforme. I denne undersøgelse har vi forsøgt at kontrollere nogle af disse variabler ved at lynfryse vævene, opbevare dem ved – 80 °C, forhindre optøning før ekstraktion og anvende de mest anbefalede metoder til miRNA-ekspressionsanalyse. F.eks. har det vist sig, at brugen af sekvensspecifikke RT-primere i modsætning til en universel RT-primer er bedre til specifik produktamplifikation . qPCR anses for at være guldstandarden til analyse af miRNA- og målekspression på grund af dens følsomhed og specificitet i forhold til globale profileringsplatforme. Det er vigtigt, at kvaliteten af de opnåede resultater er vigtigere end det blotte antal miRNA’er, der profileres fra store sekventeringsbaserede platforme. Selv om vi ikke sammenlignede virkningen af miRNA-berigelse fra vores RNA-prøver, har tidligere rapporter desuden frarådet dette, navnlig for globale miRNA-profileringsplatforme, selv om vi ikke sammenlignede effekten af miRNA-berigelse fra vores RNA-prøver. For eksempel fandt Redshaw et al. (2013), at den korte RNA-berigelsesprocedure resulterer i betydeligt lavere relative miRNA-niveauer, når man sammenligner total RNA og beriget materiale, specifikt reducerede berigelsesproceduren kopiantallet af miRNA’er med op til 25 % af det, der er til stede fra præberigede prøver, og at dette tab varierede for forskellige miRNA-sekvenser. Derfor er miRNA-data fra totale og korte RNA-præparater muligvis ikke direkte sammenlignelige. Desuden er det blevet foreslået, at større RNA kan fungere som bærer for små RNA’er . Hvorvidt miRNA-berigede metoder til alle virksomheder ville resultere i bedre genvinding fra væv, er endnu ikke afgjort. Selv om Bioline foreslår et separat kit til miRNA-isolering, brugte vi Isolate II total RNA-kittet til direkte sammenligning med andre ekstraktionsmetoder, da det miRNA-specifikke kit ikke tillader isolering af både korte og lange RNA’er fra den samme eluering. I stedet beriges og isoleres miRNA-arter først, hvorefter lange RNA’er kan ekstraheres bagefter, hvilket resulterer i to separate fraktioner. Selv om Isolate II ikke er optimeret til isolering af små RNA’er som miRVana- eller miRNeasy-sættene, var den heller ikke overlegen med hensyn til målgenekspressionen. I betragtning af den store diskrepans mellem visse kits bør forskere vælge en mere robust ekstraktionsmetode.