shRNA – Anvendelser – Hvad er shRNA, hvordan det virker og dets anvendelser.

Hvad er shRNA, og hvordan bruger man det?

Short hairpin RNA-sekvenser (shRNA) er normalt kodet i en DNA-vektor, der kan indføres i celler via plasmidtransfektion eller viral transduktion. shRNA-molekyler kan opdeles i to hovedkategorier baseret på deres design: simpelt stam-loop- og mikroRNA-adapteret shRNA. Et simpelt stam-loop shRNA er ofte transskriberet under kontrol af en RNA Polymerase III (Pol III)-promotor . Transkriptet med 50-70 nukleotider danner en stam-loop-struktur bestående af et 19-29 bp stort område med dobbeltstrenget RNA (stammen), der er forbundet med et område med overvejende enkeltstrenget RNA (løkken) og et dinukleotid 3′-overhæng . Det simple shRNA med stamme-loop transskriberes i kernen og går ind i RNAi-vejen på samme måde som et præ-mikroRNA. Det længere (> 250 nukleotider) mikroRNA-adapterede shRNA er et design, der i højere grad ligner indfødte pri-mikroRNA-molekyler, og består af en shRNA-stamstruktur, der kan omfatte mikroRNA-lignende mismatches, som er forbundet af en løkke og flankeret af 5′- og 3′-endogene mikroRNA-sekvenser . Det mikroRNA-tilpassede shRNA er ligesom den simple stam-loop-hårnåle også transskriberet i kernen, men det antages, at det går ind i RNAi-vejen tidligere ligesom et endogent pri-mikroRNA.

shRNA-teknologier er DNA-baserede, hvilket giver fleksibilitet i designet af vektoren. De fleste vektorbaserede shRNA-systemer indeholder en selekterbar markør for at muliggøre eliminering af celler, der ikke er blevet transficeret eller transduceret med succes, og vedligeholdelse af celler med vedvarende genknockdown. shRNA-ekspressionskassetterne kan også inkorporeres i virale vektorsystemer, herunder retrovirus, adeno-associeret virus, adenovirus og lentivirus, som muliggør stabil integration i og ekspression fra værtsgenomet. Disse virale strategier muliggør shRNA-levering til cellelinjer, der er refraktære over for transfektion. Fluorescerende markører (f.eks. grønt eller rødt fluorescerende protein) kan også anvendes til at spore celler, der udtrykker shRNA’er. shRNA’s ydeevne påvirkes af mange faktorer, herunder effektiviteten af transduktion eller transfektion, den promotor, der driver ekspressionen af shRNA’et, og epigenetiske modifikationer (som kan føre til, at shRNA-ekspressionen bliver tavset). Endvidere kan den indflydelse, som hver af disse faktorer har på vektorens ydeevne, variere afhængigt af cellelinjen eller celletypen . SMARTchoice-promotor- og reportermuligheder er tilgængelige for at hjælpe forskerne med at vælge optimale promotorer til shRNA-ekspression og genudslettelse. Endelig, når disse shRNA-ekspressionskassetter er koblet med inducerbare promotorer, som med SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA eller TRIPZ-vektorsystemet, kan forskerne designe undersøgelser for at modulere genekspressionen tidsmæssigt og rumligt .

Videoanimation: RNA-interferens

Hvordan leveres shRNA til en celle?

Der er to muligheder for DNA-baseret shRNA-levering til celler. For plasmider kan der anvendes typiske transfektionsmetoder som f.eks. anvendelse af lipidtransfektionsreagenser eller elektroporation. Lentivirale partikler er et glimrende valg til vanskeligt transficerbare celler og i situationer, hvor der er behov for høj effektivitet, eller hvor der skal leveres flere konstrukter pr. celle. De fleste moderne vektorer har selekterbare markører, der muliggør selektiv aflivning af celler i kulturen, som ikke blev transficeret eller transduceret med succes, så der kan udvikles en ren kultur.

Hvad påvirker shRNA-funktion og specificitet?

Optimal genknockdown er et krav for vellykket RNAi ved hjælp af shRNA-systemer. Rationel udformning af shRNA-sekvenser har i vid udstrækning været baseret på algoritmer, der er udviklet med siRNA. Mens nogle siRNA-designregler gælder for shRNA, vil mere raffinerede shRNA-designalgoritmer sandsynligvis forbedre målgenudryddelse for shRNA’er i fremtiden . Med henblik på at forudsige funktionelle shRNA-sekvenser vælger Dharmacons SMARTvector™ shRNA-algoritme målsekvenser på grundlag af en lang række kriterier, herunder positionsafhængige nukleotidpræferencer, sekundærstruktur og termodynamiske stabilitetsprofiler, der er specifikke for SMARTvector microRNA-baserede stilladset. SMARTvector-algoritmen omfatter desuden flere kriterier til at øge specificiteten.

Som med siRNA’er kan bioinformatiske metoder anvendes til at skabe målspecifikke shRNA’er, samtidig med at potentialet for off-target-effekter minimeres. Det er kendt, at høje koncentrationer af silencingintermediater bidrager til off-target-hændelser, men niveauet af intermediaterne er vanskeligt at kontrollere, når shRNA’er udtrykkes eksogent. Adskillige publikationer har dokumenteret beviser for, at høje niveauer af simpel stam-loop shRNA-ekspression under specifikke betingelser kan mætte den endogene RNAi-vej og føre til utilsigtede fænotyper . Andre undersøgelser har antydet, at brugen af et mikroRNA-tilpasset shRNA kan reducere den cellulære toksicitet ved in vivo RNAi-forsøg, fordi disse scaffolds behandles mere effektivt af både Drosha-DGCR8 og Dicer .

shRNA-applikationer

shRNA giver mulighed for forlænget gen-stumning. Transduktion af viralbaseret shRNA giver adgang til celler, f.eks. primære og neuronale celler, som det er vanskeligt at transficere ved hjælp af traditionelle kationiske lipidbaserede strategier. Viralbaseret shRNA er også blevet anvendt til at evaluere genfunktion på hele genomskalaen ved hjælp af puljer af silencing-konstruktioner. Pooled eller arrayed screens anvendes nu i vid udstrækning til at udføre high-throughput screens for at identificere gener, der er nødvendige i en række processer såsom kræftcellers overlevelse og proliferation , tumor suppressor pathway komponenter , modulatorer af pattedyrs cirkadiske ur , undertrykkere af epithelial-mesenkymal overgang , værtsmediatorer af HIV-1 replikation og regulatorer af celle migration . Styrken af pooled RNAi screening er også blevet udvidet til screening for genfunktion i dyremodeller for at undersøge in vivo biologi.

Hvilket shRNA-værktøj er det rigtige til dine behov?

shRNA Selection Guide

Vi tilbyder et udvalg af shRNA-reagenser og biblioteker. Denne hurtige udvælgelsesguide vil hjælpe dig med at bestemme den bedste løsning til dine særlige behov.

Featured Products

shRNA – Produkter

• Lentivirale vektor-baserede reagenser til RNA-interferens.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Gør smarte, informerede valg for succesfuld gen-silencering i dine celler af interesse.

SMARTvector Inducible shRNA

• Den mest avancerede og fleksible enkeltvektor-inducerbare shRNA, der er tilgængelig til stramt kontrolleret genudryddelse.

Pooled Lentiviral Screening Libraries

• Optimeret konstruktion af puljer af høj kvalitet, komplette analyseværktøjer og validerede protokoller er afgørende for et vellykket resultat ved screening med poolede lentivirale biblioteker.

Featured Resources

shRNA – Resources

• Find produktguider, FAQ’er og meget mere.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Teknisk note, der beskriver SMARTchoice shRNA-eksperimentel arbejdsgang i suspensionsceller.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Teknisk manual

• Platformen er et innovativt system, der er ideelt velegnet til RNAi-medierede undersøgelser.

GIPZ Lentiviral shRNA – Teknisk manual

• Eksperimentelle protokoller til nedbrydning af gener ved hjælp af GIPZ lentiviral shRNA.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA-biogenese: koordineret beskæring og skæring. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Et system til stabil ekspression af korte interfererende RNA’er i pattedyrceller. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Stabil undertrykkelse af genekspression ved hjælp af RNAi i pattedyrceller. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Effektiv ekspression af small interfering RNA i humane celler. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Andengenerations shRNA-biblioteker, der dækker musens og menneskets genomer. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Funktionel analyse af forskellige promotorer i lentivirale vektorer på forskellige stadier af in vitro-differentiering af embryonale stamceller fra mus. Molekylær terapi 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentivirale vektorer til øget genekspression i humane hæmatopoietiske celler. Molekylær terapi 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-lignende familie af transkriptionsfaktor 9, en differentieringsassocieret transkriptionsfaktor, undertrykker Notch2-signalering og hæmmer glioblastom-initierende stamceller. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji koordinerer kontrol af PRC2 enzymatisk aktivitet og målgenbelægning i pluripotente celler. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Cytoplasmatisk FANCA-FANCC-kompleks interagerer med og stabiliserer det cytoplasma-dislokaliserede leukæmiske nukleophosminprotein (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Funktionel identifikation af optimerede RNAi-udløsere ved hjælp af et massivt parallelt sensorassay. Molekylær celle 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatalitet hos mus på grund af overmætning af cellulære mikroRNA/kort hårnåle RNA-veje. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Kunstige miRNA’er afbøder shRNA-medieret toksicitet i hjernen: implikationer for den terapeutiske udvikling af RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Syntetiske shRNA’er som potente RNAi-udløsere. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC kobler mikroRNA-biogenese og post-transkriptionel gennedbrydning. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Meget parallel identifikation af essentielle gener i kræftceller. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profilering af essentielle gener i humane brystceller ved multiplex RNAi-screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Cancerproliferationsgenopdagelse gennem funktionel genomforskning. Science 319(5863): 620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Kandidatbiomarkører for respons på et eksperimentelt kræftlægemiddel identificeret gennem en storstilet RNA-interferens genetisk screening. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) En storstilet funktionel RNAi-screening afslører en rolle for CK2 i pattedyrs cirkadiske ur. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 er en negativ regulator af epithelial-mesenchymal overgang og metastase i brystkræft. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) En genom-dækkende short hairpin RNA-screening af jurkat T-celler for menneskelige proteiner, der bidrager til produktiv HIV-1-replikation. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) En genom-dækkende RNAi-screening identificerer flere RSK-afhængige regulatorer af cellemigration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) En onkogenomisk baseret in vivo RNAi-screening identificerer tumorsuppressorer i leverkræft. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Terapeutisk hæmning af miR-208a forbedrer hjertefunktionen og overlevelsen under hjertesvigt. Circulation 124(14):1537-1547.