Positiv funktionel synergi af strukturelt integrerede kunstige proteindimerer sammensat ved hjælp af Click chemistry

Click chemistry interface sites

Vi formodede, at områder af et proteins overflade, der er kompatible med hensyn til associering, er mere tilbøjelige til at generere en integreret struktur gennem dannelse af gensidigt kompatible ikke-kovalente interaktioner. Da proteinerne er monomere, er disse interaktioner i bedste fald svage og forbigående, så de vil ikke vare ved, og vi ræsonnerede, at vi havde brug for en molekylær “bolt” som en del af grænsefladestedet for at fremme og stabilisere eventuelle nye interaktioner. Det første skridt er at identificere regioner på målproteinerne, som har et iboende potentiale til at interagere. ClusPro 2.040 (cluspro.org) blev anvendt til at generere potentielle dimerkonfigurationer. De udførte sfGFP-homodimermodeller blev raffineret, analyseret og rangeret ved hjælp af RosettaDock41,42 (Supplerende tabel 1). Den højest rangerede konfiguration er vist i fig. 1b (som er den model, der er tættest på den bestemte struktur nedenfor; vide infra), og de næste 4 rangerede konfigurationer er vist i supplerende fig. 1. Mens der blev observeret forskellige orienteringer af den ene sfGFP i forhold til den anden, viste docking, at resterne 145-148, 202-207 og 221-224 rutinemæssigt blev fundet at bidrage til dimergrænsefladen. For at skrue de to proteiner sammen blev der anvendt genetisk kodet bioorthgonal Click-kemi (fig. 1a). Fordelen i forhold til f.eks. disulfidforbindelser omfatter længere sidekæder til at overvinde potentielle steriske sammenstød, forbedret krydsforbindelsesstabilitet og evnen til at generere ikke-symmetriske (forskellige forbindelsesrester på forskellige monomerer) og heterodimere på en designet 1-til-1 måde (vide infra).

Baseret på dimer-modellerne blev tre rester udvalgt til udskiftning med de to Click-kompatible ncAA’er, SCO43 (strained alkyne) og azF (azid)44,45 (Fig. 1a). H148 og Q204 blev valgt på grundlag af deres placering ved den formodede dimergrænseflade (fig. 1b og supplerende fig. 1). Begge rester er kendt for at blive let modificeret med små molekylære cyclooctynaddukter ved azF-inkorporering34,46 og ligger tæt på det funktionelle center, sfGFP-kromoforen (CRO) (Fig. 1b). Gelmobilitetsforskydningsanalyse viste, at dimeriseringen var vellykket (fig. 1c, d); dette blev bekræftet ved massespektrometrianalyse (supplerende fig. 2). Residue 132 blev ikke forudsagt at være ved dimergrænsefladen (Fig. 1b og Supplementary 1), men er kendt for at være kompatibel med en række spændte alkyneaddukter, der spænder fra farvestoffer46 til kulstofnanorør35 til enkeltstrenget DNA36. Den fungerer således som en god test af vores evne til at forudsige protein-protein-grænseflader og Click-reaktionskompatibilitet. På trods af at rest 132 er overfladeeksponeret, blev der ikke observeret noget dimerprodukt ved brug af sfGFP132azF med SCO-holdigt protein (Supplerende fig. 3), hvilket indikerer vigtigheden af overfladegrænsefladekompatibilitet og nytten af in silico-analyse til at hjælpe med at identificere klikkemikompatible steder. Enten steriske sammenstød og/eller protein-protein-interaktioner, der fortsætter i længere tid ved andre regioner, kan hindre kovalent krydsforbindelse ved rest 132.

Positiv funktionel omskiftning ved dannelse af sfGFP148x2 dimer

H148 danner en H-binding med CRO (Fig. 1b) og spiller en vigtig rolle i protonshuttling, der regulerer populationen af den neutrale A (λmax ~ 400 nm, CRO A) og den anioniske B-form (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 , der er til stede i grundtilstanden. B-formen dominerer i sfGFP, men ved inkorporering af azF i stedet for H148 (sfGFP148azF) resulterer fjernelse af H-bindingen i, at A-tilstanden nu dominerer33,34 (fig. 2a og tabel 1). Inkorporering af SCO på rest 148 (sfGFP148SCO) fremkalder en lignende effekt, hvor CRO A dominerer, men med en mindre rødforskydning (λmax 492 nm) i den mindre CRO B-form (Fig. 2a og Tabel 1).

Dimerisering af sfGFP148azF og sfGFP148SCO giver to væsentlige positive virkninger: (i) slår fluorescensen på ~490 nm på grund af fremme af CRO B-formen; (ii) stærkt forbedret lysstyrke gennem øget molær absorbanskoefficient ved 490 nm (Fig. 2a og Tabel 1). Den vigtigste excitationstop er rødt forskudt ved dimerisering (λmax 492 nm) sammenlignet med sfGFPWT (λmax 485 nm) (Supplerende tabel 3). Absorptionsforholdet 490:400 nm forskydes med en størrelsesorden fra ~0,5 for monomererne til ~5 for dimeren, idet CRO B-formen dominerer dimerens absorbansspektrum (Fig. 2a) på trods af den tilsyneladende mangel på en art, der kan erstatte H148-imidazolgruppens rolle (Fig. 2a). Tidligere eksempler på modificering af sfGFP148azF med små molekyleaddukter eller fotoaktivering resulterer i bedste fald i delvis omdannelse til CRO B-form33,34. Det 10-dobbelte skift i absorbans afspejles i fluorescensemission; excitation ved 490 nm resulterer i ~20 gange højere emission end begge monomerer (fig. 2a). Desuden viser dimeren en forbedret funktion, selv sammenlignet med den oprindelige superfolder sfGFPWT (fig. 2b og tabel 1). Molar absorbans og lysstyrke steg ~320% for sfGFP148x2 (~160% på en per CRO-basis) (Fig. 2b) højere end forventet for en simpel additiv stigning, hvis monomerenhederne virker uafhængigt af hinanden.

For at undersøge betydningen af den biorthogonale forbindelse konstruerede vi en klassisk disulfidbaseret forbindelse ved at mutere H148 til cystein. sfGFPH148C-varianterne dimeriserede, men kun i nærvær af Cu2+ (Supplerende fig. 4). De spektrale egenskaber tydede på, at dimeren var mindre fluorescerende sammenlignet med sfGFP148x2 og sfGFPWT (Supplerende fig. 4). Monomeren sfGFPH148C viste det forventede skift fra CRO B til CRO A. Selv om der blev observeret et skift fra CRO A til CRO B ved dimerisering af sfGFPH148C, havde dimeren en lavere pr. CRO-molær absorbans end sfGFPWT og betydeligt mindre end sfGFP148x2; der blev stadig observeret en betydelig population af A-tilstanden. Fluorescensemissionen ved excitation ved 490 nm for dimerisk sfGFPH148C var ca. halvt så stor som for sfGFPWT. Således genererede den biorthogonale tilgang en bedre fungerende dimerisk art end klassisk disulfidbindingsbinding.

Molekylært grundlag for funktionel switching i sfGFP148x2

Krystalstrukturen af sfGFP148x2 (se supplerende tabel 2 for statistik) afslører, at monomerne danner en omfattende dimergrænseflade med langtrækkende interaktioner, der forbinder de to CRO-centre. Monomerenhederne i sfGFP148x2 arrangerer sig i et kvasi-symmetrisk head-to-tail arrangement, der er forskudt ~45° i forhold til hinanden (fig. 3a). Den antiparallelle side-by-side-arrangement af monomererne er tættest på den højest rangerede model (supplerende figur 1 og supplerende tabel 1). Elektronetætheden af den nye triazol-krydsforbindelse er klart defineret (fig. 3b) og danner den langstrakte anti-1,4-triazolforbindelse, der er delvist begravet og intimt forbundet med begge monomerenheder, så den udgør en integreret del af dimergrænsefladen (fig. 3c). CRO’erne ligger 15 Å fra hinanden og peger mod hinanden (fig. 3a).

Grænsefladen har samme karakteristika som naturlige dimerer48. Det begravede grænsefladeareal er ~1300 Å2 , hvor generelt de samme rester fra hver monomer bidrager (fig. 3c, d). H-binding spiller en vigtig rolle med rester E142, N146, S147, N149 og N170 fra begge monomerer, der bidrager til otte H-bindinger mellem underenhederne (fig. 3b). Strukturen viser, at naturlige dimergrænseflader kan efterlignes og stabiliseres ved hjælp af Click-linkede monomerer, som ifølge den oprindelige modellering var mulige, men som sandsynligvis var for svage eller forbigående til at bestå uden det indlejrede link. Det kan således være, at vores fremgangsmåde kan bruges til at stabilisere mere bredt forbigående svage protein-protein-interaktioner, således at der dannes definerede grænseflader.

Dimerisering inducerer en række konformationsændringer for at danne et langtrækkende interaktionsnetværk, der ligger til grund for den mekanisme, hvormed sfGFP tændes og lysstyrken øges. Strukturen sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 viser, at 148azF indtager en lignende position som H148 i sfGFPWT, men ikke kan fra den kritiske H-binding til CRO phenol OH-gruppen, der fremmer dannelsen af CRO B-tilstanden. Ved dimerisering medfører modifikation af 148azF gennem dannelse af triazolforbindelsen med 148SCO i den beslægtede monomer en ændring i både dens rygsøjle og sidekædestilling, hvilket medfører et hul, der nu kan besættes af et vandmolekyle i dimeren (W1azF i fig. 4a). Vandet kan H-binde sig til CROazF og rygsøjlecarbonylet i 148azF (fig. 4). Et tilsvarende vand er til stede i sfGFP148SCO-monomerenheden (W1SCO), som danner lignende interaktioner. Disse strukturerede vandmolekyler har potentiale til at erstatte den H-båndsinteraktion, der går tabt ved fjernelse af H148, hvorved dimeren aktiveres ved at fremme dannelsen af CRO B i grundtilstanden. Vandmolekylerne er også begravet ved dimergrænsefladen, så den dynamiske udveksling med bulkopløsningsmidlet vil være meget reduceret. Desuden er de to CRO’er nu forbundet af et udvidet, overvejende vandnetværk, der spænder over dimergrænsefladen (fig. 4b, c). En analyse af tunnelsammensætningen viste, at tre vandmolekyler i hver enhed (W1azF/SCO, W2azF/SCO og W3azF/SCO) er symmetriske; W4 kombineret med F145SCO’s rygsøjle danner broen over dimergrænsefladen for at forbinde de to vandnetværk sammen. Dimerisering genererer således et udvidet, inter-monomer vandrigt H-båndsnetværk mellem monomerer og fremmer således et skift fra A-tilstanden CRO til B-formen.

Enkle molekyle fluorescensanalyse af sfGFP148x2

Total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi blev anvendt til at undersøge den fluorescerende adfærd af sfGFP148x2 dimerer på enkeltmolekylniveau. Fluorescensintensitetstidsforløbet for enkelte sfGFP148x2-dimere viste en række intensitetstilstande, hvor fluorescens ved ~80-100 tællinger dominerede og udviste større lang levetid end subpopulationen af højere intensitetstilstande, hvor disse var karakteriseret ved korte udfald til en række intensiteter fra ~100 til 300 tællinger (fig. 2c). Fluorescenssporene viser også en langvarig fotostabilitet med lange perioder til fotoblegning (fig. 2c og supplerende fig. 5). Til sammenligning fotoblegner sfGFPWT hurtigere, og fluorescenssporene viser en enkelt intensitetstilstand, hvor on-tilstandene generelt varer kortere tid (supplerende figur 6). Desuden blev monomer sfGFPWT undertiden fundet at eksistere i en indledende mørk, ikke-fluorescerende tilstand, før fluorescens startes og efterfølgende fotoblegning (Supplerende fig. 6). Udtrækning af den gennemsnitlige sammenhængende fluorescens “on time” før fotoblegning og besættelse af forbigående ikke-fluorescerende tilstande (blink) viser, at sfGFP148x2 viser længere perioder med kontinuerlig fluorescens (gennemsnit 0,9 s) sammenlignet med sfGFPWT (0,65 s). I betragtning af ligheden i den målte enkeltmolekylefluorescensintensitet bidrager de øgede ON-tider og fotoblegningslevetiden sandsynligvis til den øgede fluorescens, der er observeret i steady state ensemblemålinger af sfGFP148x2 (Fig. 2a).

I et forsøg på at rationalisere rækken af fluorescenstilstande, der er observeret i dimer-sporene, blev der genereret et histogram af alle målte intensiteter (Fig. 2c). I modsætning til sfGFPWT (Supplerende fig. 6), der viser en enkelt log-normal fordeling49 , favoriserede sfGFP148x2 en tokomponentpasning50 (fig. 2c). Den målte intensitetsfordeling viser et fremherskende peak med lavere intensitet (~90 counts) og et delvist overlappende peak med højere intensitet som følge af de korte udflugter til højere intensitetstilstande, der er observeret i sporene af enkeltmolekylfluorescens. Mens man normalt kunne forvente en bimodal intensitetsfordeling i en dimer bestående af to samlokaliserede, uafhængigt aktive fluorophorer, hvor hver fluorophor sekventielt fotobleges, er de enkelte molekylers intensitetstidsforløb ikke i overensstemmelse med denne model og viser en mangel på to veldefinerede tilstande. Den simple on/off-tilstandsadfærd hos sfGFPWT observeres sjældent i dimer-sporingerne, som ikke i sig selv fremstår som det forventede addukt af to monomeriske spor, men i stedet viser en mere kompleks adfærd.

Forbedret funktion ved dannelse af sfGFP204x2-dimer

For at undersøge, hvordan forskellige koblingssteder kan fremkalde funktionelle virkninger, undersøgte vi den alternative dimer sfGFP204x2 (Fig. 5a), der er konstrueret ovenfor (Fig. 1d). Vi fandt, at dimerisering forbedrede de spektrale egenskaber i forhold til den simple tilføjelse af de monomere eller sfGFPWT-proteiner, hvilket igen fremhæver de synergistiske fordele ved dimerisering. Indarbejdelse af enten azF eller SCO ved rest 204 havde kun en lille effekt på spektrale egenskaber sammenlignet med sfGFPWT 46 (Fig. 5b og Tabel 1). B CRO-formen dominerede i de monomere former; både den molære absorbans og emissionsintensiteterne var ens for hinanden og sfGFPWT. Fluorescensemissionen af sfGFP204SCO var en smule reduceret (80 % af sfGFPWT; tabel 1). Ved dannelse af sfGFP204x2-dimer (se fig. 1d og supplerende fig. 2 for beviser) viste spektralanalyse en funktionel forbedring med hensyn til de centrale spektrale parametre: molær absorbanskoefficient (ε) og fluorescensemission (fig. 5b og tabel 1). Ved dimerisering steg ε med op til 400 % i forhold til startmonomerne til 160 000 M-1 cm-1. Dette svarer til en gennemsnitlig per CRO-molær absorbans på 80.000 M-1 cm-1 , hvilket næsten fordobler lysstyrken sammenlignet med startmonomerne og 31.000 M-1 cm-1 højere sammenlignet med sfGFPWT. I overensstemmelse med den øgede evne til at absorbere lys blev fluorescensemissionen også øget; den normaliserede pr. CRO-emission var 180 % højere end sfGFP204azF-monomeren. Ved hjælp af Strickler-Berg51 -beregningen (websted huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) falder fluorescenslevetiden fra 3,2 ns for sfGFPWT til 0,92 ns for sfGFP204x2. Som med sfGFP148x2 har den dimeriske struktur af sfGFP204x2 således en øget sandsynlighed for elektronisk excitation og fluorescensudgang sammenlignet med monomeriske former (se supplerende fig. 8 for spektral sammenligning af dimere). Dette er så meget desto mere imponerende for begge dimerformer, da sfGFPWT er et benchmark for grønt fluorescerende proteins ydeevne.

Symmetriens betydning for synergi

Naturlige proteinhomodimere er generelt symmetriske1,52 , og en sådan symmetri blev efterlignet i vores kunstige dimer gennem en fælles tværbindingsrest. Vi undersøgte betydningen af en fælles tværbindingsrest (som en efterligning af strukturel symmetri) for funktionel synergi. Fordelen ved biorthogonal kemi er, at de gensidigt kompatible reaktionshåndtag giver mulighed for konstruktion af definerede par (dvs. 148 + 204 = 148-204 og ikke 148-148 eller 204-204), således at der ikke dannes uønskede produkter, som vil være vanskelige at adskille.

Dimere blev genereret, der forbandt rest 148 og 204 i de to tilgængelige kombinationer (148SCO+204azF og 148azF+204SOC). Steady state-fluorescens afslørede, at i begge dimerformer var de protonerede og deprotonerede former af CRO tydeligt til stede (Fig. 6a, b). Den 148azF-204SCO-knyttede dimer udviste en ændring i de relative populationer af A- og B-formerne med en betydelig stigning i den molære absorbanskoefficient ved 490 nm (Fig. 6a); den var næsten dobbelt så stor som den oprindelige sfGFP204SCO og ~30% højere end den, der var forudsagt ved simpel addition af monomerspektierne. Den relative højde af 400 nm-toppen forbliver ens i både sfGFP148azF og den 148azF-204SCO-forbundne dimer, hvilket tyder på, at populationen af den deprotonerede form er den samme i dimeren som i den oprindelige monomer. Dimerisering via 148SCO-204azF-kombinationen ændrede de relative populationer af de protonerede og deprotonerede former, men reduktionen i 400 nm absorbanstoppen blev ikke modsvaret af en samtidig stigning i 490 nm-toppen (fig. 6b). Faktisk var dimeriseringen i høj grad skadelig, da begge større absorbanspeaks havde en lavere molær absorbanskoefficient end de simple additionsspektre af monomererne (Fig. 6b). Det er klart, at de asymmetrisk forbundne dimerer er mindre fluorescerende og indeholder en betydelig blandet population af de to CRO-tilstande sammenlignet med de symmetrisk forbundne dimerer, så i dette tilfælde har symmetri vigtige funktionelle implikationer.

Heterodimere og funktionel integration

Heterodimere, hvor en dimer er sammensat af to forskellige proteiner, er en almindeligt observeret alternativ dimeriseringstilstand1,2. Det giver os også mulighed for at designe nye komplekser, hvori funktionelt forskellige proteiner kan forbindes. Fordelen ved bioorthogonal kobling er muligheden for at generere definerede (hetero)dimerer af en enkelt art, der består af to forskellige proteinenheder (dvs. A + B = A-B og ikke A-A, B-B, A-B-blanding, som kan være vanskelig at adskille). Det gule fluorescerende protein Venus29 blev valgt som partnerprotein til sfGFP på grund af det spektrale overlap mellem de to (supplerende fig. 9). Sekvensforskelle er vist i supplerende fig. 10.

SfGFP148SCO blev kombineret med den tilsvarende azF-holdige Venus (Venus148azF) for at generere GFVen148 (se supplerende fig. 11 for beviser). Der fremkommer nye spektrale egenskaber, der tyder på, at der er blevet genereret et integreret system. Dannelse af GFVen148 genererer en dimer, der viser forbedret lysstyrke sammenlignet med enten sfGFP148SCO eller Venus148azF (Fig. 7a og Supplerende tabel 3). Det er interessant, at dimeren har spektrale egenskaber, der ligger mellem de individuelle monomerer uden nogen betydelig spidsudvidelse (fig. 7a, b og supplerende fig. 12a), hvilket tyder på, at de to CRO-centre er blevet funktionelt integreret med hensyn til fluorescensemission. Den største λmax er 505 nm, hvilket ligger mellem sfGFP (492 nm) og Venus (517 nm). ε-ækvivalenten til B CRO-formen (490-510 nm-regionen) stiger betydeligt (~4-5 gange) og er højere end de simple additive spektrer for monomererne, mens A CRO-populationen falder, men stadig observeres (Fig. 7a). Dette modsvares af en ~4-dobbelt stigning i emissionsintensiteten ved excitation ved 505 nm (fig. 7b). Der observeres et enkelt emissionstop, som også ligger mellem de to monomerer, uanset excitationsbølgelængden (λEM ved 517 nm; Fig. 7b, c); der blev observeret et enkelt snarere end et dobbelt eller udvidet top ved excitation ved 490 nm (i stand til at excitere begge CRO’er), hvilket tyder på, at der er tale om en enkelt art, der emitterer. Et additivt spektrum af individuelle monomerspektre, der simulerer to uafhængigt virkende proteiner, understøtter ideen om en ny integreret funktion, da det er bredere og rødforskudt sammenlignet med den målte GFVen148x2-emissionsprofil (Supplerende fig. 12b). Emission ved excitation ved 400 nm blev også målt, da Venus148azF har en lille absorbans ved denne bølgelængde sammenlignet med GFVen148. Emissionsintensiteten var 30 gange højere for GFVen148 sammenlignet med monomer Venus148azF med emissionstoppen ved 517 nm (fig. 7c og supplerende fig. 12c). I stedet for at udvise klassisk FRET, som man kunne forvente (se ovenfor), synes GFVen148 at optræde som en enkelt enhed med hensyn til fluorescensoutput. Dette kunne tyde på, at to CRO’er nu overvejende optræder som én art, hvor de strukturelle aspekter, der er observeret for sfGFP148x2 (som f.eks. vandnetværket), spiller en rolle. Tilstedeværelsen af en betydelig neutral A-tilstand i CRO’en tyder på, at de to monomeriske enheder ikke er fuldt synkroniserede. Dette ophæver dog ikke den klare indvirkning, som dimerisering kan have på genereringen af nye spektrale egenskaber som dem, der ses i GFVen148.

Som med sfGFP havde inkorporering af azF i stedet for Q204 (benævnt Venus204azF) kun en lille effekt på Venus’ spektrale egenskaber (Supplerende tabel 3). Kovalent binding via 204 SPAAC (hvilket gjorde GFVen204) genererede med succes en dimer (Supplerende fig. 11). GFVen204 kombinerede de spektrale egenskaber af begge monomerer og genererede en art med λMax ved både 490 og 514 nm (forholdet 1:1,2) (Fig. 7e, f og Supplerende tabel 3) (Fig. 7e, f og Supplerende tabel 3). Venus204 absorberer også ved 490 nm, men i et forhold på 1:2,7 til 514 nm. Dannelse af dimerer øgede igen den molære absorbans over den for de individuelle monomerer; især ε steg med ~26.000 M-1 cm-1 (~27%) for den Venus-associerede λmax (514 nm), hvor der er et lille bidrag for sfGFP. For at undersøge kommunikationen mellem monomererne blev fluorescensemission ved excitation ved fire separate bølgelængder overvåget: 400 nm (kun sfGFP); 450 nm (sfGFP, mindre Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venus-skulder); 510 (Venus, mindre sfGFP). Ved alle excitationsbølgelængder var det eneste klare emissionstop ved 528 nm (fig. 7b), svarende til Venus, der indikerer kommunikation ved Förster-resonans-energioverførsel (FRET). Et emissionstop, der korrelerer med sfGFP204SCO (~510 nm), blev ikke observeret, selv ikke ved excitation ved de lavere bølgelængder, der er specifikke for sfGFP. Der blev heller ikke observeret den mellemliggende emissionstop, der er karakteristisk for GFVen148, hvilket fremhæver de nye egenskaber ved 148-heterodimeren. Den mest signifikante forskel blev observeret ved excitation ved 400 nm, hvor der er en 14-dobbelt stigning i emissionsintensiteten ved 528 nm for GFVen204 sammenlignet med Venus204azF (fig. 7f, indsat). Den beregnede relative FRET-effektivitet efter spektral dekomponering var ca. 90 %. De to funktionelle centre kommunikerer således gennem energioverførsel (fig. 7g) på en meget effektiv måde.