Regulering af motilitet af det centrale par
Motilitetsændringer som reaktion på eksterne stimuli kan tage to former. Stimulus kan ændre frekvensen af tilfældige omorienteringer, som det sker i bakterier, så motilitet i en gunstig retning belønnes, eller stimulus kan direkte regulere motiliteten, så organismen drejer i en bestemt retning i forhold til stimulus (mod stimulus for positive taxier, væk for negative taxier). En sådan taktisk drejning kræver lokaliserede receptorer, der kan fungere som en antenne, og et motilitetsapparat, der kan styres retningsbestemt (Foster og Smyth, 1980). En simpel stop-reorientering-start-type regulering kræver ikke en sofistikeret regulering af motiliteten. I flageller kræver retningsbestemt styring koordinerede ændringer i bølgeform og slagfrekvens og derfor et mere sofistikeret reguleringsapparat. Det centrale par-radiale egesystem udfylder denne rolle i 9+2 cilia og flageller, som det mest elegant er demonstreret i Chlamydomonas (fig. 1D). Denne encellede biflagellate alge reagerer på fototaktiske stimuli ved at ændre den relative bølgeform, slaghastighed og slagfrekvens for sine to flageller (Witman, 1993). De foreliggende beviser tyder på, at phototaxis involverer en signaltransduktionsvej fra det centrale apparat, gennem radiale eger, til et dobbelt-associeret regulatorisk kompleks, som derefter ændrer mønsteret af dyneinaktivitet og dermed af bøjedannelse og -udbredelse gennem ændringer i dynein-associerede proteinkinaser og fosfataser (Porter og Sale, 2000; Smith og Yang, 2004).
Mens der kan have været mere end én mulig måde at danne et asymmetrisk centralt apparat på, kan et apparat bygget på et minimalt stillads af to mikrotubuli have været den første, der udviklede sig, og det ville kræve en minimal ændring af protocilium, primært tilføjelsen af et nyt samleinitieringssted i overgangszonen sammen med en struktur (radial spoke) til at overføre signaler fra det centrale apparat til de dobbelt-associerede dyneiner. Vi forestiller os, at radiale eger udviklede sig fra dyneinregulering i ark af doubletter, hvor de ved deres baser interagerede med et doublet-associeret dyneinreguleringskompleks og ved deres spidser med mikrotubulus-associerede proteiner på en anden række af doubletter eller på et kortikalt singlet mikrotubuluscytoskelet. Det forekommer bemærkelsesværdigt, i betragtning af sandsynligheden for at flagellære dyneiner udviklede sig fra cytoplasmatiske dyneiner, at der ikke kendes nogen fælles reguleringsmekanismer for disse to dynein-familier. Dette kan imidlertid afspejle vores nuværende mangel på viden snarere end et fravær af konserverede mekanismer. Nylige molekylære analyser af et protein i Chlamydomonas dyneinreguleringskomplekset afslørede en primær struktur, der har ligheder med cytoplasmatiske proteiner, men en relation til cytoplasmatisk dynein er ikke blevet fastslået (Rupp og Porter, 2003).
Det er fortsat en stor gåde at finde ud af specifikke mønstre af interaktion mellem projektioner fra det centrale par mikrotubuli og radiale eger, der fremkalder specifikke ændringer i dyneinaktivitet. Nylige resultater fra vores laboratorium, herunder analyse af normal centralparstruktur, karakterisering af mutanter med defekt samling af centralpar og bestemmelse af centralparorientering under bøjningspropagation, begrænser modellerne for, hvordan CP regulerer dynein. Her forsøger vi at opstille en hypotese om centralparregulering, der er i overensstemmelse med disse resultater.
Tidligere tyndsnits-elektronmikroskopi af Chlamydomonas og Tetrahymena axonemer sammen med negative farvningspræparater af centrale parkomplekser fra Tetrahymena cilia (Chasey, 1969) og rottesædflageller (Olson og Linck, 1977) afslørede den asymmetriske struktur af centrale parkomplekser og definerede CP-mikrotubulus med længere projektioner i tværsnit og 32 nm gentagelsesperiodicitet som C1, mens det andet (C2) har kortere projektioner med kun 16 nm gentagelser. Ved at sammenligne tværgående og langsgående tyndsnit af centrale parkomplekser af vild type med centrale parkomplekser fra assembleringsmutanterne pf6 og cpc1 bestemte jeg de strukturelle relationer og gentagelsesperioder for de fleste af de C1- og C2-associerede projektioner i Chlamydomonas. Overfladebilleder leveret af stereobilleder af hurtigt frosne, dybe ætsningspræparater bekræftede og udvidede disse konklusioner og resulterede i en ret komplet 3-d rekonstruktion af det centrale par (Mitchell, 2003a). Disse undersøgelser giver en model af potentielle spøgeinteraktionssteder på det centrale par og viser især diskontinuiteter i den ellers cylindriske overflade af CP langs mikrotubulusoverfladerne, der vender mod tilstødende spøgehoveder. Det fremhæves også den overordnede asymmetri af CP-komplekset, hvilket tyder på unikke spoke-interaktioner på forskellige radiale positioner omkring CP-cylinderen. Kloning af pf6 (Rupp et al., 2001) og cpc1 (Mitchell og Sale, 1999; Zhang og Mitchell, 2004) generne og identifikation af deres genprodukter identificerede ikke åbenlyse kandidater til proteiner, der interagerer med radiale eger, men et kinesinlignende protein (Klp1) på C2 mikrotubulus (Bernstein et al., 1994) er en attraktiv kandidat til et egerbindende protein. Vi har for nylig vist, at flageller i Klp1 knockdown-celler slår med dramatisk reducerede frekvenser (Mitchell og Yokoyama, 2003).
EM-undersøgelser viser, at CP opretholder en fast orientering i forhold til cellekroppen og de ydre doubletter i nogle organismer, mens CP i andre organismer har en variabel orientering. Fylogenetisk set synes en fast orientering at være en afledt forenkling i organeller, der har et fast bøjningsplan, såsom ctenophore kampladecilia (Tamm og Tamm, 1981) og mange metazoers spermatozoer (Sale, 1986). I ekstreme eksempler er C1- og C2-mikrotubuli fastgjort til henholdsvis doublet 8 og 3 ved hjælp af permanente forbindelser (enten modificerede eger eller accessoriske strukturer). I det modsatte ekstrem er cilia og flageller hos encellede organismer, der er afhængige af hurtige ændringer i bølgeform, slagfrekvens og effektiv slagretning for at reagere på signaler fra omgivelserne. CP’erne i disse organeller er snoede, så de ikke opretholder en fast orientering fra basis til spids inden for de omkringliggende 9 doubletter. Desuden roterer disse snoede CP under bueudbredelse (Omoto et al., 1999). Vi har for nylig vist, at Chlamydomonas CP er orienteret parallelt med bøjningsplanet inden for hver bøjning (Fig. 1D) og vrider sig 180° mellem på hinanden følgende hoved- og omvendte bøjninger, og at C1-mikrotubulus altid er tættest på doubletterne på ydersiden af hver bøjning (Mitchell, 2003b). Denne konstante orientering af CP i forhold til en bøjning i Chlamydomonas gør det muligt for et sæt CP-projektioner at interagere med radiale eger, der er knyttet til doubletter med aktive dyneiner, mens et andet sæt CP-projektioner interagerer med radiale eger på doubletter med inaktive dyneiner.
Men selv om slaghulen er næsten plan i Chlamydomonas, og hovedbøjningens retning ikke ændrer sig dramatisk væk fra et konstant plan, er dette ikke tilfældet i andre organismer. Hvis CP-orienteringen også følger bøjningsorienteringen i disse andre organismer, som jeg foreslår, så er CP altid positioneret til at give fleksibel motilitetskontrol. Vores seneste resultater viser, at CP-orienteringen passivt tilpasser sig bøjningerne, når de dannes ved basen af en Chlamydomonas flagellum, og at denne bøjningsafhængige orientering derefter flyttes, når hver bøjning forplanter sig fra basis til spids. En analogi fra ingeniørvidenskaben er et sneglehjul, hvor sneglen (det centrale par) roterer i forhold til den vinkelrette bevægelse (bøjningsudbredelse) af de indbyrdes forbundne tandhjul i et tandhjul med tænder (axonemale bøjninger). Retningen af en hovedbøjning kan derfor ikke bestemmes af det centrale pars orientering, som passivt tilpasser sig bøjningerne, men skal reguleres på det ydre doubletniveau gennem initieringsmønstre ved flagellarbasen. Regulerende signaler fra CP kan derefter bestemme form og slagfrekvens gennem direkte modulering af dyneinaktivitetsmønstre inden for udviklende og udbredte bøjninger. Denne hypotese er i overensstemmelse med resultaterne fra vibrationsmæssig omorientering af slagplanet i søpindsvin-axonemerne (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Hvis det nye bøjningsplan induceret af vibrationer tvinger en ny orientering af det centrale par, så ville afslapning af systemet efter fjernelse af den pålagte vibration fra disse celler kræve en gradvis rotation af det centrale par tilbage til dets hvilestilling. Desværre blev der ikke opnået oplysninger om den faktiske CP-orientering i disse eksperimenter. Denne hypotese er også i overensstemmelse med det mønster af doubletglidning, der er observeret i protease-behandlede Chlamydomonas axonemer, hvor doubletglidningsmønstre opretholder et konstant forhold til det centrale pars orientering (Wargo og Smith, 2003; Wargo et al., 2004), og med undersøgelser af dyneinaktivitet i forstyrrede Chlamydomonas- (Smith, 2002) og søpindsvin- (Yoshimura og Shingyoji, 1999; Nakano et al., 2003) axonemer, som viser calcium- og centralparafhængig aktivitetsmodulation.
Af hvilken forudsigelsesværdi er disse spekulationer om udviklingen af cilia og flageller? For det første opstiller vi en hypotese om, at udviklingen af flagellaroverflademotilitet er primitiv og sandsynligvis vil blive mødt bredt, selv i ciliære derivater end ikke slår. Det er klart, at IFT er en væsentlig og universel motilitet for samling af både motile og ikke-motile organeller, så forbindelsen af dette maskineri til ekstracellulær bevægelse kan være lige så udbredt. For det andet er afsondringen af receptorer på ciliarmembraner også primitiv og udgør sandsynligvis et vigtigt selektivt pres for den fortsatte eksistens af ikke-motile primære cilier samt mere stærkt modificerede cilier i sanseorganer. Da ciliære derivater leverer væsentlige funktioner i sensoriske neuroner i mange organismer, er der kun behov for et lille spring i fantasien for at foreslå, at protocilium også udgjorde den forfædte platform for alle sensoriske processer, og at yderligere træk ved denne organel kan være fælles i sensoriske transduktionskaskader. For det tredje er centrosomets orientering som en indikator for cellepolaritet og migrationsretning for bevægelige celler også meget primitiv. Hvis det er tilfældet, tyder protociliumets betydning som en tidlig determinant for cellepolaritet og rettet migration på, at der bør søges flere forbindelser mellem mekanismer, der bestemmer cellepolaritet, og mekanismer, der orienterer centrosomer/centrioler sammen med den cytoplasmatiske mikrotubulusmatrix. Endelig må centralparrets regulering af cilier og flageller også have udviklet sig meget tidligt i den eukaryote evolution, før udstrålingen af alle eksisterende eukaryote fylaer. Selv om der utvivlsomt findes forskelle i den detaljerede regulering, der kræves af disse organeller i forskellige organismer og celletyper, bør vi forvente at finde mange universelle træk i den måde, hvorpå interaktioner mellem centralparret og radiale eger regulerer dyneinaktiviteten, og vi kan endnu finde fælles temaer i reguleringen af axonemale og cytoplasmiske dyneinmotorer.