Northern Blot

En generel blotting-procedure starter med ekstraktion af total RNA fra en homogeniseret vævsprøve eller fra celler. Eukaryote mRNA kan derefter isoleres ved hjælp af oligo(dT)-cellulosekromatografi for kun at isolere de RNA’er, der har en poly(A)-hale. RNA-prøverne adskilles derefter ved gelelektroforese. Da gelerne er skrøbelige, og proberne ikke kan trænge ind i matrixen, overføres RNA-prøverne, der nu er adskilt efter størrelse, til en nylonmembran via et kapillær- eller vakuumblotting-system.

En nylonmembran med en positiv ladning er den mest effektive til brug ved northern blotting, da de negativt ladede nukleinsyrer har en høj affinitet for dem. Den transferbuffer, der anvendes til blotting, indeholder normalt formamid, fordi det sænker annealingstemperaturen for interaktionen mellem sonde og RNA og dermed eliminerer behovet for høje temperaturer, som kan forårsage RNA-nedbrydning. Når RNA’et er blevet overført til membranen, immobiliseres det ved kovalent binding til membranen ved hjælp af UV-lys eller varme. Når en sonde er blevet mærket, hybridiseres den til RNA’et på membranen. Eksperimentelle betingelser, der kan påvirke hybridiseringens effektivitet og specificitet, omfatter ionstyrke, viskositet, duplexlængde, mismatchede basepar og basesammensætning. Membranen vaskes for at sikre, at sonden er bundet specifikt, og for at forhindre, at der opstår baggrundssignaler. Hybridsignalerne påvises derefter med røntgenfilm og kan kvantificeres ved densitometri. For at skabe kontroller til sammenligning i et northern blot kan prøver, der ikke viser det pågældende genprodukt, anvendes efter bestemmelse ved mikroarrays eller RT-PCR.

GelsEdit

RNA-prøverne adskilles oftest på agarosegeler, der indeholder formaldehyd som denatureringsmiddel for RNA for at begrænse sekundærstrukturen. Gelerne kan farves med ethidiumbromid (EtBr) og ses under UV-lys for at observere kvaliteten og mængden af RNA før blotting. Polyacrylamidgelelektroforese med urinstof kan også anvendes til RNA-separation, men den anvendes oftest til fragmenteret RNA eller mikroRNA’er. Der køres ofte en RNA-stige sammen med prøverne på en elektroforese-gel for at observere størrelsen af de opnåede fragmenter, men i totale RNA-prøver kan de ribosomale underenheder fungere som størrelsesmarkører. Da den store ribosomale underenhed er 28S (ca. 5 kb) og den lille ribosomale underenhed er 18S (ca. 2 kb), vises der to markante bånd på gelen, hvoraf det større bånd har næsten dobbelt så høj intensitet som det mindre bånd.

ProbesEdit

Probes til northern blotting består af nukleinsyrer med en komplementær sekvens til hele eller en del af RNA af interesse, de kan være DNA, RNA eller oligonukleotider med mindst 25 komplementære baser til målsekvensen. RNA-sonder (riboprober), der er transskriberet in vitro, kan tåle strengere vasketrin, hvilket forhindrer en del af baggrundsstøjen. Almindeligvis oprettes cDNA med mærkede primere for den pågældende RNA-sekvens, der skal fungere som sonde i nordblotet. Proberne skal mærkes enten med radioaktive isotoper (32P) eller med kemiluminescens, hvor alkalisk fosfatase eller peberrodsperoxidase (HRP) nedbryder kemiluminescerende substrater og frembringer en detekterbar lysemission. Kemiluminescensmærkningen kan ske på to måder: enten er sonden knyttet til enzymet, eller også er sonden mærket med en ligand (f.eks. biotin), hvortil liganden (f.eks. avidin eller streptavidin) er knyttet til enzymet (f.eks. HRP). Røntgenfilm kan detektere både radioaktive og kemiluminescerende signaler, og mange forskere foretrækker de kemiluminescerende signaler, fordi de er hurtigere og mere følsomme og reducerer de sundhedsrisici, der følger med radioaktive mærker. Den samme membran kan undersøges op til fem gange uden et væsentligt tab af mål-RNA.