26.3.1.1.1 T1R-receptorerne: Transduktion af søde og umami-smagskvaliteter
De første metabotrope receptorer, der blev identificeret i gustation, var to medlemmer af T1R-familien, T1R1 og T1R2 (oprindeligt kaldet TR1 og TR2),41 og de blev opdaget ved subtraktive og differentielle enkeltcelle-screeningsteknikker. Disse receptorer viser ca. 40 % homologi med hinanden og er fjernt beslægtede med andre GPCR’er som f.eks. den kalciumsensoriske receptor, V2R-færomonreceptoren og de metabotrope glutamatreceptorer. Alle er medlemmer af GPCR-klasse C-familien og har det særlige kendetegn, at de har et langt N-terminalt ekstracellulært domæne, kendt som Venusfluefang-domænet, til fælles. In situ-hybridiseringseksperimenter viste, at disse receptorer udtrykkes i 20-30 % af TRC’erne i forreste og bageste smagsløg. Endvidere er de til stede i næsten alle hvirveldyr, men ikke i hvirvelløse dyr.39
I første omgang var ligander for disse receptorer ukendte, selv om man på baggrund af deres ekspression i den forreste tunge foreslog sød transduktion. Mange spekulerede i, at generne for disse receptorer ville være kortlagt på sac-lokussen, et område på distale kromosom 4, som tidligere ved genetiske undersøgelser var blevet identificeret som værende involveret i sød smag hos mus. Fuller42 , der studerede musestammer, der adskiller sig fra hinanden i deres lyst til at indtage søde opløsninger, konstaterede, at de fleste forskelle i saccharinpræference i smags- og ikke-smagende stammer (henholdsvis C57BL/6J og DBA/2J) var afhængige af et enkelt locus, kaldet sac. Den dominerende form af allelen er korreleret med den mere akutte præference. Senere undersøgelser generaliserede dette fund til yderligere søde molekyler såsom acesulfam, dulcin og saccharose,43,44 og bemærkede, at formodede polymorfismer i generne påvirkede den perifere nerveaktivitet.45 Ved hjælp af genetisk kortlægning med høj opløsning blev T1R1 imidlertid kortlagt proximalt i forhold til sac-lokus.46
Identiteten af sac og dens relation til T1R-familien af receptorer blev klar, da det tredje familiemedlem, T1R3, blev opdaget.47-49 T1R3 udtrykkes i både forreste og bageste felter i TRC’er, hvis morfologi er i overensstemmelse med type II-celler. Den samudtrykkes med enten T1R1 eller T1R2, selv om en brøkdel af T1R3-udtrykkende TRC’er ikke samudtrykker nogen af delene.50 T1R3-celler samudtrykkes med andre elementer i den søde transduktionskaskade, der omfatter α-gustducin og PLCβ2. Eksperimenter med heterologe ekspressionssystemer viste, at T1R3 kræver koekspression af T1R2 for at være fuldt ud responsiv over for en lang række søde stoffer såsom simpelt sukker, kunstige sødestoffer, d-aminosyrer og søde proteiner.48,51 Den humane T1R2/T1R3-dimer reagerede på omkring tyve forbindelser, der vides at være søde ved fysiologiske koncentrationer, og blev hæmmet af lactisol, en human antagonist for sød smag.51 Gennem en kombination af fysisk kortlægning og genomdatabase mining identificerede flere grupper en T1R3 som sac i gnaver- og humane genomer.47-49,51-54
Validering af T1R2/T1R3 som den vigtigste receptor for sød smag hos pattedyr blev opnået ved undersøgelser med knockout mus for T1R1, T1R2 eller T1R3 generne samt en dobbelt knockout mus for T1R2 og T1R3 generne. Disse mus blev testet ved hjælp af adfærdstest med kortvarig adgang og elektrofysiologiske optagelser fra chorda tympani og glossopharyngeale nerver.55,56 T1R2-null-mus udviste tab af præference og neurale reaktioner for kunstige sødemidler og stærkt formindskede reaktioner for naturlige sukkerstoffer. T1R3-null-mus mistede adfærdsmæssige og elektrofysiologiske responser for både umami-stimuli og kunstige sødemidler og havde stærkt formindskede responser for sukkerstoffer. Kun dobbelt knockout-dyret mistede fuldstændigt de resterende reaktioner på naturlige sukkerstoffer, hvilket tyder på, at T1R2 eller T1R3 kan fungere som en monomer eller en homodimer. Faktisk reagerede HEK-293-celler, der udtrykker mus T1R3 alene, på højt sukker;50 interessant nok blev disse reaktioner ikke observeret med human T1R3. Disse knockout-undersøgelser viste utvetydigt den afgørende rolle, som T1R-proteinerne T1R2 og T1R3 spiller for detektion og opfattelse af sødt. På samme måde har Felidae-familien i en fascinerende naturlig knockout erhvervet en loss-of-function-mutation i T1R2-genet tidligt i evolutionen og har følgelig mistet sød smag, hvilket forklarer kattens ligegyldighed over for sukker.57
Hvordan kan så få sødreceptorer forklare det store antal arter og individuelle forskelle i opfattelsen af sød smag? Disse forskelle kan forklares ved forskelle i gensekvenser på tværs af arter og ved polymorphismer inden for en art. Ved heterolog ekspression reagerede kun human T1R2/T1R3 på aspartam og cyklamat, mens receptorer fra rotte, som er ligeglade med disse forbindelser, ikke reagerede.51 Mere bemærkelsesværdigt er det, at T1R2-null mus, der udtrykker det humane T1R2-transgen, viste responser på flere molekyler, der af mennesker anerkendes som søde, og som mus er ligeglade med.55 Inden for en art er der flere polymorfismer fra flere musestammer, der klart adskiller disse dyrs smagende og ikke-smagende status.54,58 Disse polymorfismer virker ikke ved at blokere genekspression eller proteinoversættelse, men men menes snarere at forstyrre evnen til at danne dimerer eller binde sødemidler. Hos mennesker er polymorfismer, der er forbundet med T1R3-promotoren, med til at forklare de velkendte forskelle i smagsfølsomhed over for saccharose.59
Et andet paradoks, der opstår ved opdagelsen af søde receptorer, er, hvordan så få receptorer kan genkende en så forskelligartet vifte af stimuli som kulhydrater, aminosyrer, proteiner og kunstige sødestoffer. Struktur-funktionsundersøgelser af disse receptorer har identificeret flere bindingsdomæner inden for dimer-komplekset, hvilket forklarer, hvordan en så stor diversitet kan mødes.60,61 For eksempel er Venusfluefang-domænet i T1R2 påkrævet for aspartam- og neotambinding, T1R3 transmembran-domænet er påkrævet for cyklamat,62,63 og den cysteinrige region i T1R3 er påkrævet for at reagere på det søde protein brazzein.64 Lactisol, en sød antagonist, binder sig til en lomme inden for transmembrandomænet af human T1R3;65 interessant nok forklarer ændringen af to aminosyrer i transmembran 5-domænet af rotte-receptoren dens ufølsomhed over for denne antagonist.66 Til dato er alle fire domæner i T1R2/T1R3-dimeren – de to N-terminale domæner og de to transmembrandomæner – blevet impliceret i binding af ligander, hver med forskellige affiniteter til de tilsvarende ligander.
Mange af de samme eksperimentelle strategier, der bekræftede T1R2/T1R3 som den søde receptor, har på samme måde bekræftet T1R1/T1R3 som umamireceptor. Når den heterologisk udtrykkes, reagerer den menneskelige T1R1/T1R3-dimer selektivt på l-glutamat,51 mens musedimeren er mere promiskuøs blandt sine ligander og reagerer på stort set alle l- (men ikke d-) enantiomerer af de 20 standardaminosyrer.48,67 Knockout-undersøgelser dokumenterer yderligere T1R1/T1R3-dimeren som umami-receptor. Knockout af T1R1 eller T1R3 eliminerede adfærdsmæssige og elektrofysio-logiske smagsresponser på glutamat.55 Desuden er et karakteristisk træk ved umami-smag dens potentiering af ribonukleotider som f.eks. inosin-5′-monofosfat (IMP) og guanosin-5′-monofosfat (GMP). Denne potentiering observeres på samme måde ved heterolog ekspression og er fraværende hos T1R1- eller T1R3-knockout-mus. I modsætning til receptoren for sød smag er de funktionelle domæner af umamireceptoren mindre udforsket. Ved hjælp af chimære receptorer, site-directed mutagenese og molekylær modellering er der blevet foreslået en kooperativ ligandbindingsmodel, hvor glutamat binder til Venus fluefælde-domænet af T1R1 (tæt på hængselsregionen), og IMP binder til et tilstødende sted, der stabiliserer konformationsændringen.68
Der er stadig debat om, hvorvidt T1R1/T1R3-dimeren er den eneste funktionelle glutamatreceptor i TRC’er.50,69 Før opdagelsen af T1R-familien blev en unik trunkeret form af mGluR4-receptoren, der udtrykkes i TRC’er, rapporteret som umamireceptoren.70 Det er imidlertid blevet påpeget, at denne receptor mangler en stor del af Venus fluefang-domænet, som er afgørende for glutamatbinding, og mangler synergi for glutamat og ribonukleotider.50 Disse egenskaber gør det mindre sandsynligt, at den er en kandidatreceptor for umami. Ikke desto mindre lader vanskeligheden ved at adskille natrium- og glutamatreaktionerne på MSG, de resterende umamireaktioner hos nogle T1R3 knockout-mus56 og reduktionen af glutamatreaktioner på mGluR-antagonister71 spørgsmålet om flere umamireceptorer stå åbent.