Enzymer varierer i specificiteten af de substrater, de binder til, for at kunne udføre specifikke fysiologiske funktioner. Nogle enzymer kan have behov for at være mindre specifikke og kan derfor binde til mange substrater for at katalysere en reaktion. På den anden side kræver visse fysiologiske funktioner ekstrem specificitet hos enzymet i forhold til et enkelt specifikt substrat, for at der kan opstå en korrekt reaktion og fysiologisk fænotype. De forskellige typer af kategoriseringer adskiller sig fra hinanden på grundlag af deres specificitet for substrater. Mest generelt er de inddelt i fire grupper: absolut, gruppe-, bindingsværks- og stereokemisk specificitet.
Absolut specificitetRediger
Absolute specificitet kan opfattes som værende eksklusiv, hvor et enzym virker på ét specifikt substrat. Absolut specifikke enzymer vil kun katalysere én reaktion med sit specifikke substrat. For eksempel er laktase et enzym, der er specifikt for nedbrydning af laktose til to sukker-monosaccharider, glukose og galaktose. Et andet eksempel er Glucokinase, som er et enzym, der er involveret i fosforylering af glukose til glukose-6-fosfat. Det er primært aktivt i leveren og er det vigtigste isoenzym af hexokinase. Dens absolutte specificitet henviser til, at glukose er den eneste hexose, der kan være dens substrat, i modsætning til hexokinase, der kan rumme mange hexoser som substrat.
GruppespecificitetRediger
Gruppespecificitet opstår, når et enzym kun vil reagere med molekyler, der har specifikke funktionelle grupper, såsom aromatiske strukturer, fosfatgrupper og methylgrupper. Et eksempel er Pepsin, et enzym, der er afgørende for fordøjelsen af de fødevarer, der indtages i vores kost, og som hydrolyserer peptidbindinger mellem hydrofobiske aminosyrer med genkendelse af aromatiske sidekæder såsom phenylalanin, tryptofan og tyrosin. Et andet eksempel er hexokinase, et enzym, der er involveret i glykolysen, som fosforylerer glukose for at producere glukose-6-fosfat. Dette enzym udviser gruppespecificitet ved at tillade flere hexoser (sukkerarter med 6 kulstofatomer) som sit substrat. Glukose er et af de vigtigste substrater i metaboliske veje, der involverer hexokinase, på grund af dets rolle i glykolysen, men det er ikke det eneste substrat, som hexokinase kan katalysere en reaktion med.
BindingsspecificitetRediger
Bindingsspecificitet genkender i modsætning til gruppespecificitet bestemte kemiske bindingstyper. Dette adskiller sig fra gruppespecificitet, da det ikke er afhængig af tilstedeværelsen af bestemte funktionelle grupper for at katalysere en bestemt reaktion, men snarere en bestemt bindingstype (f.eks. en peptidbinding).
Stereokemisk specificitetRediger
Denne type specificitet er følsom over for substratets optiske aktivitet af orientering. Stereokemiske molekyler adskiller sig ved den måde, hvorpå de roterer plan polariseret lys, eller orienteringer af bindinger (se alpha, beta glykosidiske bindinger). Enzymer, der er stereokemisk specifikke, vil binde substrater med disse særlige egenskaber. F.eks. vil beta-glykosidase kun reagere med beta-glykosidbindinger, som er til stede i cellulose, men ikke i stivelse og glykogen, som indeholder alfa-glykosidbindinger. Dette er relevant for, hvordan pattedyr er i stand til at fordøje føde. For eksempel findes enzymet amylase i pattedyrs spyt, som er stereospecifikt for alfa-bindinger, og derfor kan pattedyr effektivt udnytte stivelse og glykogen som energiformer, men ikke cellulose (fordi det er en beta-binding).