Hvordan fungerer ionbytningskromatografi?

Ionbytningskromatografi (IEX) er en teknik, der ofte anvendes til rensning af biomolekyler. Den indebærer adskillelse af molekyler på grundlag af deres ladning.

Denne teknik udnytter interaktionen mellem ladede molekyler i en prøve og modsat ladede enheder i den stationære fase i kromatografimatrixen. Denne type separation er vanskelig at foretage ved hjælp af andre teknikker, da ladningen let kan manipuleres ved hjælp af pH-værdien af den anvendte buffer.

Der er to typer ionbyteseparation mulig – kationbytning og anionbytning. Ved anionbytning er den stationære fase positivt ladet, mens den ved kationbytning er negativt ladet.

Princippet bag ionbytningskromatografi

IEX-kromatografi anvendes til separation af ladede biomolekyler. Den rå prøve, der indeholder ladede molekyler, anvendes som den flydende fase. Når den passerer gennem den kromatografiske søjle, binder molekylerne sig til modsat ladede steder i den stationære fase.

De molekyler, der adskilles på grundlag af deres ladning, elueres ved hjælp af en opløsning med varierende ionisk styrke. Ved at lade en sådan opløsning passere gennem kolonnen sker der en meget selektiv adskillelse af molekylerne i henhold til deres forskellige ladninger.

Teknikken

Nøglepunkterne i ionbytningskromatografiproceduren er anført nedenfor:

• En uren proteinprøve lægges i ionbytningskromatografikolonnen ved en bestemt pH-værdi.
• Ladede proteiner binder sig til de modsat ladede funktionelle grupper i harpiksen
• Der anvendes en saltgradient til at eluere de separerede proteiner. Ved lave saltkoncentrationer elueres proteiner med få ladede grupper, og ved højere saltkoncentrationer elueres proteiner med flere ladede grupper.
• Uønskede proteiner og urenheder fjernes ved vask af kolonnen.

En pH-gradient kan også anvendes til eluering af individuelle proteiner på grundlag af deres isoelektriske punkt (pI), dvs. det punkt, hvor aminosyrerne i et protein bærer neutral ladning og derfor ikke vandrer i et elektrisk felt. Da aminosyrer er zwitter-ionforbindelser, indeholder de grupper med både positive og negative ladninger. På grundlag af omgivelsernes pH-værdi bærer proteinerne en positiv, negativ eller ingen ladning. Ved deres isoelektriske punkt vil de ikke interagere med de ladede grupper i kolonneharpiksen, og de elueres derfor. En faldende pH-gradient kan anvendes til at eluere proteiner ved hjælp af en anionbytterharpiks, og en stigende pH-gradient kan anvendes til at eluere proteiner fra kationbytterharpikser. Dette skyldes, at en forøgelse af den mobile fases buffer-pH-værdi medfører, at proteinet bliver mindre protoneret (mindre positivt ladet), så det ikke kan danne en ionisk vekselvirkning med den negativt ladede harpiks, hvilket muliggør eluering. Omvendt vil en sænkning af pH-værdien i den mobile fase medføre, at molekylet bliver mere protoneret (mindre negativt ladet), hvilket muliggør dets eluering.

Harpiksvalg i ionbytterkromatografi

Ionbytterharpikser har positivt eller negativt ladede funktionelle grupper, der er kovalent knyttet til en fast matrix. Matrialerne er normalt fremstillet af cellulose, polystyren, agarose og polyacrylamid. Nogle af de faktorer, der påvirker valget af harpiks, er anion- eller kationbytter, flowhastighed, svag eller stærk ionbytter, partikelstørrelse af harpiksen og bindingskapacitet. Stabiliteten af det pågældende protein dikterer valget af en anion- eller kationbytter – begge byttere kan anvendes, hvis stabiliteten ikke giver anledning til bekymring.

Anvendelserne af ionbytterkromatografi

Ionbytning er den mest udbredte kromatografiske metode til separation og oprensning af ladede biomolekyler såsom polypeptider, proteiner, polynukleotider og nukleinsyrer. Dens udbredte anvendelighed, høje kapacitet og enkelhed samt dens høje opløsning er de vigtigste årsager til dens succes som separationsmetode. Ionbytningskromatografi anvendes i vid udstrækning i flere industrielle anvendelser, hvoraf nogle er følgende:

• Separation og oprensning af blodkomponenter såsom albumin, rekombinante vækstfaktorer og enzymer.
• Bioteknologi – Analytiske anvendelser såsom kvalitetskontrol og procesovervågning
• Fødevareforskning og klinisk forskning – til undersøgelse af hvedesorter og sammenhængen mellem proteinuri og forskellige nyresygdomme.
• Fermentering – Kationbytterharpikser anvendes til at overvåge fermenteringsprocessen under produktion af ß-galactosidase.

Videre læsning

• Alt indhold om kromatografi
• Kromatografi i oversigt
• Gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) – anvendelser
• Højtydende væskekromatografi (HPLC)
• Væske-kromatografi-Massespektrometri (LC-MS) Applikationer

Citationer