Jeg tilhører en hæmatologisk interessegruppe og nyder altid at se de casestudier og spørgsmål, som andre techs poster. Denne gruppe er multinational, så jeg ser indlæg fra teknikere fra hele verden. Det er interessant at se lighederne og forskellene i standardprocedurer og de roller, som teknikere spiller i forskellige områder og forskellige lande. Det er også interessant at se, at vi alle støder på de samme typer problemer og vanskelige prøver!I de sidste par måneder i denne interessegruppe for hæmatologi har jeg set mange spørgsmål og kommentarer om løsning af sammenklumpede blodplader, og jeg benytter derfor denne lejlighed til at kaste lys over disse vanskelige prøver. Det tilfælde, som jeg præsenterer, og billederne er venligst udlånt af Abu Jad Caesar, som er laboratoriechef hos Medicare Laboratories – Tulkarm-afdelingen i Palæstina.
Patienten fik foretaget en CBC på en Nihon Kohden 6410. WBC var 12,7 x 103μL, impedanspladetallet var 20.000/μL ved første kørsel, andre parametre syntes inden for normale grænser. Prøven blev opvarmet, og der blev anmodet om et Na Citrat-rør for at udelukke pseudothrombocytopeni. efter opvarmning blev EDTA-prøven genudført med et trombocyttal på 0/μL. Na-citratrøret blev kørt, og blodpladetallet fra instrumentet var 189.000/μL. (Figur 1) På grund af forholdet mellem blod og antikoagulans i Na Citrate-røret blev der anvendt en multiplikator på 1,1, hvorved Na Citrate-blodpladetallet blev 207 900/μL. Der blev fremstillet, farvet og undersøgt objektglas. Billede 1 viser sammenklumpningen i EDTA-røret. Billede 2 viser udstrygningen fra Na Citrat-røret, hvor der ikke er nogen visuel sammenklumpning.
CBC’en blev rapporteret med følgende kommentarer: Blodplader klumpning observeret, 2 prøver udtaget for at udelukke trombocytopeni. EDTA-helblodudstrygning havde mange trombocytklumper konstateret (EDTA-induceret trombocytopeni). Konklusion: Trombocytter er tilstrækkelige og anslås til at være ca. 200 000/μL.
Tallet af blodplader i normalområdet giver os normalt ikke så mange problemer med at rapportere, selv om der er en vis klumpning, hovedsagelig fordi de er normale. Et passende antal trombocytter ligger inden for et typisk referenceområde på omkring 150-450 x 103/μL.Hvis der er instrumentflag for et unormalt scattergram for trombocytter eller trombocytklumper, anbefales det at gentage testningen med en anden metode. Hvis den første tælling er udført ved hjælp af impedancetælling, kan mange analysatorer også rapportere optiske eller fluorescerende trombocyttællinger. Ved impedancetælling kan meget småRBC’er eller fragmenter blive talt som trombocytter, hvilket giver et falsk forhøjet antal trombocytter. Ved optisk tælling kan store trombocytter tælles som RBC’er, hvilket giver et falsk nedsat antal. Nogle af Sysmex’ hæmatologiske analysatorer anvender impedans og optisk tælling og har også fluorescerende trombocyttælling, som anvender et trombocytspecifikt farvestof og giver nøjagtige trombocyttællinger uden de andre metoders forstyrrelser. Et normalt antal blodplader, selv med klumper, der kan ses på et udstrygningsbillede, vurderes normalt stadig at være normalt (eller kan lejlighedsvis være forhøjet).
Thrombocytopeni kan på den anden side være en udfordring i det hæmatologiske laboratorium. Ved trombocytopeni har lægerne brug for en nøjagtig tælling for at kunne diagnosticere, behandle eller overvåge patienterne. Selv en lille stigning eller et lille fald kan være signifikant, når der er tale om en alvorlig trombocytopeni. Med færre trombocytter tæller alle trombocytter!
Et af de første spørgsmål, vi skal stille ved en tilsyneladende trombocytopeni, er, om der er tale om en ægte trombocytopeni, eller om der er tale om pseudothrombocytopeni (PTCP). En ægte trombocytopeni repræsenterer en patient med et lavt antal trombocytter, som kan have behov for overvågning eller medicinsk intervention. Det kan være farligt at fejlfortolke trombocytopeni, men det er også farligt at rapportere et lavt antal blodplader hos en patient med en falsk trombocytopeni, som i virkeligheden ikke er trombocytopenisk. Pseudotrombocytopeni eller falsk trombocytopeni defineres som et kunstigt eller fejlagtigt lavt antal trombocytter. Ved PTCP skyldes det lave antal trombocytter klumper, der tælles som 1 trombocyt. (Disse store klumper kan også tælles som WBC’er, hvilket giver et falsk forhøjet WBC-tal).
Vi kan opdele PTCP i 2 kategorier Blodpladeklumper skyldes oftest præanalytiske fejl som f.eks. overfyldte eller underfyldte EDTA-rør, størknet prøve eller en tidsforskydning mellem prøveudtagning og testning. Teknikerne bør kontrollere røret for blodpropper og prøvevolumen og foretage en deltakontrol for at hjælpe med at skelne mellem trombocytopeni og PTCP. Men med en tilsyneladende “god” prøve vil det næste skridt være en udstrygningsundersøgelse. Hvis der ses klumper på udstrøget, skal vi beslutte, hvad der har forårsaget klumperne. Er det den første kategori, et af disse almindelige præanalytiske problemer, eller er det den anden kategori af PTCP, en in vitro-agglutination af trombocytter? Tilstande, der kan forårsage denne in vitro-agglutination af trombocytter, omfatter kolde agglutininer, multipel myelom, infektioner, antikardiolipin-antistoffer, høje immunoglobulinniveauer, abciximabbehandling og EDTA-induceret pseudothrombocytopeni. (EDTA-PTCP) Blandt disse er EDTA-induceret pseudothrombocytopeni den mest almindelige årsag. (Nakashima,2016).
Når teknikere taler om problemer med blodpladeklumper, er det normalt, fordi vi leder efter måder at løse eller præcist estimere antallet af blodplader i disse prøver på, og der synes ikke at være et enkelt svar.Klumperingen gør præcis optælling umulig, og selv estimater kan være meget vanskelige. Hvordan kan vi estimere disse tællinger? Skal vi blot rapportere tilstedeværelsen af klumpning med “synes normal”, “nedsat” eller “øget”? Eller skal vi opdele vores skøn i flere intervaller for at give lægerne mere værdifulde oplysninger? Og hvad nu, hvis behandleren ønsker en faktisk optælling for at kunne give patienten den bedst mulige pleje, og vi ikke kan løse problemet med klumperne? Hvad kan vi gøre for at give en optælling? Nogle af de første skridt, der anbefales, er at hvirvle prøven i 2 minutter for at bryde trombocytklumperne op og derefter analysere igen. Opvarmning af prøver kan også hjælpe med at opløse trombocytklumper, især i prøver med kolde agglutininer, eller som har været forsinket i testningen og er blevet transporteret eller opbevaret ved stuetemperatur eller derunder. Hvis der fortsat er klumper, og der ved genindsamling af prøven stadig opstår trombocytklumper, kan en præanalytisk fejl udelukkes, og der kan være mistanke om EDTA-induceret pseudothrombocytopeni. Mange laboratorier vil få udtaget et andet rør eller anvende en anden metode for at afhjælpe klumperne.
Så, hvad er EDTA-induceret trombocytopeni (EDTA-PTCP)? Dette er ikke repræsentativt for et bestemt klinisk billede og er ikke diagnostisk for nogen sygdom eller lægemiddelbehandling, men er et laboratoriefænomen, der skyldes tilstedeværelsen af EDTA-afhængige IgM/IgG-autoantistoffer.Disse antistoffer binder sig til trombocytmembran-glykoproteiner i tilstedeværelse af EDTA. EDTA fremkalder og forstærker denne binding ved at udsætte disse glykoproteiner for antistofferne (Geok Chin Tan, 2016). (Geok Chin Tan, 2016) Selv om det er et in vitro-fænomen, har patienter med visse tilstande, såsom maligne neoplasmer, kronisk leversygdom, infektion, graviditet og autoimmuniserede sygdomme, en øget risiko for EDTA-PTCP. EDTA-PTCP er imidlertid også blevet observeret hos patienter, der er sygdomsfrie. (Zhang, 2018)
Hvad er nogle alternative metoder til at hjælpe med at løse EDTA-induceret trombocytklumpning udfordringer? Den mest almindelige er formentlig at trække prøven om i et Na Citrat-rør. Der bør trækkes både EDTA- og Na Citrat-rør. I en ægte EDTA-PTCP, som det ses i vores case study, bør man se klumper på udstrøget fra EDTA-røret og ingen klumper på udstrøget fra Na Citrate-røret. På grund af mængden af antikoaguleringsmidlet i Na-citratrøret skal man også anvende fortyndingsfaktoren 1,1 på tællingen fra Na-citratrøret for at få et nøjagtigt antal trombocytter. Bemærk dog, at hæmatologiske analysatorer er FDA-godkendt og valideret til brug med EDTA-rør. Hvis du ønsker at anvende et andet antikoaguleringsmiddel, skal metoden valideres i dit laboratorium. Bemærk også, at alternative metoder generelt kun vil løse EDTA-PTCP og ikke klumpning på grund af andre kolde agglutininer, medicin eller sygdomme. Desuden er antikoagulantinduceret trombocytopeni ikke begrænset til EDTA. Den kan også forekomme med citrat og heparin. I en undersøgelse blev det konstateret, at op til 17 % af patienter med EDTA-PTCPalso udviste dette fænomen med citrat. Faktisk har forskere fundet, og vi har fundet i vores egne valideringer, at nogle prøver, der ikke klumper sammen i EDTA, faktisk klumper sammen i Na Citrat. Det er derfor muligt, at alternative rør ikke løser alle problemer med sammenklumpning af trombocytter. (Geok Chin Tan, 2016)
Nogle laboratorier har valideret ACD (citronsyre, trinatriumcitrat, dextrose) antikoagulerende rør til EDTA-PTCP. Ved anvendelse af denne metode skal EDTA-røret og ACD-røret køres parallelt, og der skal anvendes en omregningsfaktor, som afspejler forskellen i prøvefortyndingen i de 2 rør. Der skal vælges en parameter som f.eks. RBC for at foretage denne sammenligning. Ved at anvende en formel, der dividerer RBC i EDTA med RBC i ACD, fås et forhold, der afspejler fortyndingsforskellene mellem antikoagulanterne. Dette forhold kan derefter multipliceres med ACD-trombocyttallet for at få det ACD-korrigerede trombocyttal. (CAP Today, 2014). Nogle kilder har anbefalet ACD-rør, fordi forekomsten af sammenklumpning med NaCitrat kan være frustrerende høj. Det er en teori, at det mere sure ACD-rør kan forhindre trombocytklumpning bedre end NaCitrat. (Manthorpe, 1981)
Mindre almindeligt anvendte rør er CTAD (trinatriumcitrat,theophyllin, adenosin, dipyridamol) og heparin. CTAD virker direkte på trombocytterne og hæmmer trombocytfaktor 4 og minimerer dermed trombocytaktiveringen. Ulemperne ved CTAD-rør er, at de er lysfølsomme og skal opbevares i mørke, og at de kan være dyre. De ændrer også blodet/additivfortyndingsforholdet, så der skal anvendes kalculationer, som det er set med Na-citrat og ACD. Heparinrør er mindre almindeligt anset for at være gavnlige til at løse problemer med blodpladeklumpning, fordi heparin kan aktivere blodpladerne. Heparinrør er også dyrere og har derfor generelt ikke været et førstevalg til EDTA-PTCP.
Jeg har hørt fra teknikere, at deres laboratorier har meget gode resultater ved at bruge amikacin tilsat EDTA-rør for at forhindre uheldigt lave blodpladetal hos patienter med EDTA-PTCP. Amikacin skal tilsættes til EDTA-røret inden for 1 time efter udtagning, og testen er stabil i op til 4 timer ved stuetemperatur. Resultaterne af en undersøgelse fra 2011 viste, at tilsætning af amikacin til EDTA-røret medførte hurtig dissociation af trombocytklumperne med lille eller ingen effekt på morfologi eller indikationer. Denne metode har vist sig at være meget lovende til at rapportere nøjagtige trombocytetal hos patienter med PTCP forårsaget af flere antikoagulerende midler. (Zhou, 2011)
Det sidste antikoaguleringsrør, som jeg har set nævnt af mange teknikere i interessegruppen for hæmatologi, er Sarstedt ThromboExact-rør. Jeg har set mange indlæg fra teknikere, der bruger dem, og det ser ud til, at de har en meget god succesrate. ThromboExact-rør indeholder magnesiumsalte og er specielt beregnet til at bestemme antallet af blodplader i tilfælde af PTCP. De er i øjeblikket kun valideret til tælling af trombocytter, og prøverne er stabile i 12 timer efter indsamling.Interessant nok var magnesium før automatiserede hæmatologiske analysatorer det foretrukne antikoaguleringsmiddel til manuel tælling af trombocytter. EDTA-PTCP er blevet anerkendt, siden EDTA-automatiserede trombocytællinger blev indført i 1970’erne. I en undersøgelse fra 2013 i Tyskland blev der anvendt ThromboExact-rør med fremragende resultater til at løse multianticoagulantinduceret PTCP. Disse rør blev kommercielt tilgængelige i løbet af undersøgelsen, i 2013. (Schuff-Werner, 2013) Desværre for os i USA er disse rør ikke tilgængelige i USA. Jeg var for nylig på en konference og gik hen til Sarstedt-repræsentanterne og spurgte om disse rør. Jeg fik at vide, at de er tilgængelige i dele af Europa og Asien, men at de ikke er godkendt af FDA i USA. Jeg spurgte meget forhåbningsfuldt, om de overvejede at få FDA-godkendelse, og fik desværre at vide, at “de ikke mente, at de havde markedet til at søge om godkendelse.”
Hvilken alternativ metode dit laboratorium end vælger at bruge, anbefales det at trække et EDTA- og et alternativt rør sammen. På denne måde kan de to tællinger og tilstedeværelsen eller fraværet af klumpning i rørene sammenlignes. Vi har mange patienter, der har haft en forekomst af klumpning, men når udbyderen bestiller en Na Citrate-blodpladetælling, får vi en ny trækning af både EDTA- og Na Citrate-rørene sammen, og der ses ingen flagning eller klumpning med EDTA. I disse tilfælde er det hensigtsmæssigt at give EDTA-resultaterne, da der ikke er tegn på EDTA-PTCP.
Når en patient har et lavt PLT-tal uden nogen hæmatologisk sygdom, familiehistorie og/eller blødningstendens identificeret, og præanalytiske fejl er blevet udelukket, bør PTCP overvejes. Dette betyder ikke, at en patient med PTCP vil have et normalt antal blodplader, efter at klumperne er forsvundet. Som nævnt ovenfor har mange patienter med EDTA-PTCP hæmatologiske eller andre lidelser og kan være virkelig trombocytopeniske. Når vi løser klumpningen hos disse patienter, kan vi give udbyderen et nøjagtigt antal blodplader, hvilket er meget vigtigt for trombocytopeniske patienter.
Flowdiagrammet nedenfor (figur 4) viser nogle ting, som man skal tage hensyn til, når man har at gøre med blodpladeklumpning. Det er vores mål at løse klumpning, så vi kan rapportere et nøjagtigt antal trombocytter i tide. I det laboratorium, hvor jeg arbejder, har jeg valideret Na-citratrør, men disse ser ud til at løse klumpning hos mindre end 50 % af patienterne. Som en sidste udvej for at få et nøjagtigt antal blodplader har nogle artikler foreslået, at man tager en fingerstick og foretager en manuel tælling. Jeg har medtaget dette i skemaet som en mulighed fortianokoagulerende PTCP, men på grund af vanskelighederne ved at indsamle en god prøve og subjektiviteten af tællingerne samt problemerne i forbindelse med de nødvendige beregninger har vores patologer besluttet, at vi ikke vil foretage manuelle tællinger af trombocytter. Derfor er jeg i øjeblikket involveret i overvågning af trombocytklumpning og vil gennemføre en lille intern undersøgelse for at sammenligne ACD-, CTAD- og Na-citrat-rør parallelt. Afhængigt af disse resultater vil vi måske også teste amikacin. Hvis vi når frem til nogle oplyste konklusioner, vil jeg skrive endnu en kort blog med vores resultater!
Tak igen til Abu Jad Caesar, laboratoriechef hos Medicare Laboratories – Tulkarm-afdelingen i Palæstina, som gav mig dette skolebogsagtige perfekte tilfælde af PCTP, som let blev løst ved at opsamle i Na Citrat. Vi ville ønske, at de alle læste lærebøgerne og var lige så samarbejdsvillige!
- CAPToday, January 2014. accessed online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2nd ed. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effektiv estimering af korrekt antal trombocytter ved pseudothrombocytopeni ved hjælp af et alternativt antikoagulant baseret på magnesiumsalt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopeni på grund af trombocytklumpning: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Case Reports in Hematology. Volume 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Falsk trombocytopeni i automatiseret pladetælling. Laboratory Medicine 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacin kan tilsættes til blodet for at reducere faldet i antallet af blodplader. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM er uddannet fra Merrimack College i N. Andover, Massachusetts med en BS i medicinsk teknologi og har afsluttet sin MS i klinisk laboratorievidenskab ved University of Massachusetts, Lowell. Hun har arbejdet som medicinsk teknolog i over 30 år. Hun har arbejdet inden for alle områder af det kliniske laboratorium, men har en særlig interesse for hæmatologi og blodbanker. Når hun ikke har travlt med at være en gal videnskabsmand, kan man finde hende udenfor på cykel.