Kemikalier og reagenser
GT blev købt fra markedet i Taichung, Taiwan. IS (renhed 97 %) blev fremstillet hos Alfa Aesar (Lancaster, UK). 6,7-dimethoxycoumarin (6,7-DMC, renhed 98 %) blev leveret af Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, U.S.A.). EC (renhed 90 %), ECG (renhed 98 %), EGCG (renhed 95 %), myresyre, probenecid, phosphorsyre (iskold, 85 %) og methylparaben blev købt hos Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.). EGC (renhed 92,7 %) blev fremstillet af ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.). og ethylacetat var af LC-kvalitet og blev fremstillet af ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). Acetonitril var af LC/MS-kvalitet og blev købt hos Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.). Fetal bovin serum blev fremstillet af Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penicillin-Streptomycin-Glutamin, Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, trypsin/EDTA, Hank’s balanceret saltopløsning og 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 blev fremstillet af Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.). 6-Carboxyfluorescein blev købt fra AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, U.S.A.) og 5-carboxyfluorescein fra Acros Organics (Geel, Belgien). Milli-Q plus vand (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) blev anvendt til alle præparater.
Fremstilling og karakterisering af GT-infusion
Infusionen blev fremstillet ved at trække enten 2 eller 4 g GT i 50 mL varmt deioniseret vand (98-100 °C) i 30 min. Infusionen blev filtreret med gaze, mens den var varm, for at opnå koncentrationer på henholdsvis 40 og 80 mg/mL, som blev frisk administreret til rotter via gastrisk gavage.
Til karakterisering af GT-infusionen blev 100 μL af filtratet efter filtrering af GT-infusionen med 0,2 μm RC15-filter (Sartorious, Goettingen Tyskland) blandet med 900 μL methanol og centrifugeret for at fjerne udfældningen. Den korrekt fortyndede infusion (50 μL) blev kombineret med 50 μL 6,7-DMC-opløsning (2,0 μg/mL i methanol) som intern standard, og 5 μL blev underkastet LC-MS/MS-analyse. HPLC-systemet omfattede Accela 1250-pumpe og auto-sampler (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Den kromatografiske separation blev opnået ved hjælp af en Phenomenex® C18-analytisk kolonne (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) med et forfilter. Den mobile fase bestod af acetonitril indeholdende 0,01 % myresyre (A) og vand indeholdende 0,01 % myresyre (B) og blev programmeret i en gradient som følger: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) og 2/98 (12 min). Strømningshastigheden var 0,2 mL/min. Kolonneudløbet blev detekteret ved hjælp af H-ESI (heated-electrospray ionization) -II-sonde med Quantum Access MAX tredobbelt stage quadrupol (TSQ)-massespektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Der blev anvendt kvælstof som kappegas ved 35 arbitrære enheder og hjælpegas ved 10 arbitrære enheder. Kollisionsenergien blev indstillet til -19/18 V, sprøjtespændingen til -3000/3000 V, kapillartemperaturen til 350 °C, fordampertemperaturen til 350 °C og rørlinsens offset til -80/88 V. Følgende masseovergange blev anvendt til analyse med udvalgt reaktionsovervågning (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) og 6,7-DMC (207/151). ESI-MS-spektre blev optaget i negativ iontilstand for EC, EGC, ECG og EGCG og positiv iontilstand for 6,7-DMC.
Dyr
Hanlige Sprague-Dawley rotter (270-360 g) blev købt fra National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) og opstaldet i et konditioneret miljø med 12-timers lys/mørke-cyklus. Mad og vand blev erhvervet ad libitum indtil 12 timer før eksperimenterne. Rotterne blev inddelt i to grupper. I det første forsøg blev der anvendt 28 rotter til at bestemme virkningen af GT på serumniveauerne af IS og PCS hos CRF-rotter; i det andet forsøg blev der anvendt 14 rotter til at evaluere virkningen af GT på CRF-rotternes nyrefunktion. Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i ”The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)”, der er udgivet af Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C. Forsøgsprotokollen var blevet gennemgået og godkendt den 08/01/2014 (tilladelsesnummer: 103-126-N) af Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Etablering af CRF-model og administration af GT-infusion
CRF blev induceret via oral administration af adenin efter tidligere undersøgelser, men med visse modifikationer19,23,35,36. Kort fortalt blev adenin suspenderet i 0,5 % methylcellulose 400 (15 mg/mL) administreret oralt til 28 rotter via gastrisk gavage to gange dagligt i syv på hinanden følgende doser (15 mg/rat) i hele forsøgsperioden. På dag 4 blev serumniveauerne af IS bestemt. Ved bekræftelse af svækket nyrefunktion ved signifikant forhøjelse af IS-niveauerne i serum blev CRF-rotterne inddelt i tre grupper (8-10 rotter i hver gruppe) med sammenlignelige IS-niveauer. Den første gruppe fik 400 mg/5 mL/kg GT-infusion to gange dagligt i syv på hinanden følgende doser; den anden gruppe fik 200 mg/5 mL/kg GT to gange dagligt i syv på hinanden følgende doser; og den tredje gruppe fik 5 mL/kg vand parallelt som kontrol. På dag 8 fik rotterne den 7. dosis GT kl. 9.00 om morgenen efter en natlig faste, og blodprøverne blev indsamlet 0, 15, 30, 60, 60, 120, 180 og 360 min. efter doseringen. Det planlagte tidspunkt for blodprøvetagning og administration af adenin og GT er opsummeret i fig. 3. På hvert prøveudtagningstidspunkt blev der udtaget 0,5 mL blod under isofluranbedøvelse. Blodprøverne blev opsamlet i mikrorør og centrifugeret ved 10.000 g i 15 min. for at opnå serum, som blev opbevaret ved -20 °C før analyse.
Bestemmelse af koncentrationerne af IS og PCS i serum
Til bestemmelse af IS- og PCS-koncentrationer i serum blev 50 μL serumprøve hvirvlet med 200 μL methanol indeholdende henholdsvis 10 μg/mL 6,7-DMC eller 100 μg/mL methylparaben som interne standarder og centrifugeret for at fjerne bundfaldet, hvorefter en alikvot på 20 μL blev underkastet HPLC-analyse.
For kalibratorpræparater blev 50 μL serum tilsat en serie af koncentrationer af IS og PCS for at opnå koncentrationsintervaller på henholdsvis 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) og 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM). Den senere procedure fulgte den ovenfor beskrevne procedure for serumprøver. Kalibreringskurverne blev tegnet ved lineær regression af forholdet mellem peakarealerne (IS eller PCS og intern standard) mod de kendte koncentrationer af henholdsvis IS og PCS.
HPLC-apparatet omfattede en pumpe (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japan), en fluorescensdetektor (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) og en automatisk injektor (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japan). Apollo C18-kolonnen (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) var forsynet med en vagtkolonne (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Japan). Den mobile fase bestod af acetonitril (A)-0,1 % fosforsyre (B) og blev programmeret i en gradient på følgende måde: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) og 15/85 (24-35 min) for IS og 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) og 16/84 (24-36 min) for PCS. Detektorindstillingerne var Ex 280 nm/Em 375 nm for IS og Ex 214 nm/Em 306 nm for PCS. Flowhastighederne var 1,0 mL/min.
Effekt af GT på Cr og BUN hos CRF-rotter
I et andet forsøg blev den samme dyreprotokol som nævnt ovenfor anvendt, og koncentrationerne af Cr og BUN blev bestemt før adeninbehandling (dag 0), før GT-dosering (dag 4) og efter 7. dosis af GT (dag 8). Efter bekræftelse af svækket nyrefunktion ved signifikant forhøjelse af Cr og BUN på dag 4 blev CRF-rotterne opdelt i to grupper (7 rotter pr. gruppe) med sammenlignelige Cr-niveauer. Den første gruppe fik 400 mg/5 mL/kg GT to gange dagligt i syv på hinanden følgende doser; den anden gruppe fik 5 mL/kg vand parallelt som kontrol. På dag 8 fik rotterne den 7. dosis GT og vand efter en natlig faste, og blodprøverne blev udtaget 30 minutter senere. Cr blev bestemt ved hjælp af en kinetisk alkalisk picratmetode i et ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). BUN blev bestemt ved hjælp af urease/glutamatdehydrogenase-koblet enzymreaktion ved hjælp af samme analysator.
Cellelinje og kulturbetingelser
Konstruktion af de stabilt transficerede cellelinjer, der blev anvendt til transportundersøgelser, Chinese hamster ovary (CHO)-celler, der udtrykker hOAT1 (CHO-hOAT1), menneskelige embryonale nyre 293 (HEK)-celler, der udtrykker hOAT3 (HEK-hOAT3), og deres tilsvarende tomme vektor-transficerede kontrolcellelinjer, blev tidligere beskrevet40,41. CHO-celler blev holdt ved 37 °C med 5 % CO2 i DMEM F-12-medier (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) indeholdende 10 % serum, 1 % penicillin/streptomycin og 1 mg/mL G418. HEK-celler blev holdt ved 37 °C med 5 % CO2 i DMEM højglukosemedie (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) indeholdende 10 % serum, 1 % penicillin/streptomycin og 50 μg/mL hygromycin B. Cellerne blev dyrket i poly-D-Lysin-belagte skåle.
Fremstilling og karakterisering af serummetabolitter af GT (GTM)
For at efterligne de molekyler, der interagerer med OAT’er in vivo, blev GTM fremstillet fra rotter og karakteriseret. Kort fortalt blev GT-infusion (800 mg/10 mL/kg) indgivet oralt til rotter, der var fastende natten over. Blod blev opsamlet 15 minutter efter dosering af GT-infusion. Efter koagulering blev serummet opsamlet og hvirvlet med 3 gange methanol. Efter centrifugering ved 10 000 g i 15 min. blev supernatanten koncentreret i en roterende inddamper under vakuum til tørhed. En passende mængde vand blev tilsat til restproduktet, hvilket gav en opløsning med 10-dobbelt serumkoncentration, som blev opdelt i alikvater og opbevaret ved -80 °C til senere brug.
En del af GTM blev karakteriseret efter en tidligere metode med visse ændringer16,46. Kort fortalt blev 100 μL serumprøve blandet med 50 μL sulfatase (indeholdende 1000 enheder/mL sulfatase og 39,861 enheder/ml ß-glucuronidase), 50 μL ascorbinsyre (200 mg/mL) og inkuberet ved 37 °C i 45 min under anaerobe forhold. Efter hydrolysen blev serummet tilsat 50 μL 0,1 N HCl og derefter partitioneret med 250 μL ethylacetat (indeholdende 100 ng/mL 6,7-DMC som intern standard). Ethylacetatlaget blev inddampet under N2 til tørhed og rekonstitueret med en passende mængde mobil fase før LC-MS/MS-analysen. Den mobile fase bestod af acetonitril (A) – vand indeholdende 0,1 % myresyre (B) og blev programmeret i en gradient som følger: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) og 2/98 (12 min). Strømningshastigheden var 0,2 mL/min.
Virkninger af GTM på optagetransporten formidlet af hOAT1 og hOAT3
CHO-hOAT1- og HEK-hOAT3-celler (1 × 105 celler/brønd) blev dyrket i en 96-brøndplade. 6-carboxyfluorescein (6-CF) og 5-carboxyfluorescein (5-CF) blev anvendt som sonder til evaluering af GTM’s virkning på aktiviteten af henholdsvis hOAT1 og hOAT347,48. Desuden blev probenecid (80 μM) anvendt som en positiv kontrol for hæmning af hOAT1 og hOAT349. Efter 24 h eller 48 h inkubation af CHO-hOAT1 eller HEK-hOAT3 blev mediet fjernet og vasket tre gange med PBS-buffer. Før transportforsøget blev CHO-hOAT1- og HEK-hOAT3-cellerne forudinkuberet med teststoffer (GTM og probenecid) ved 37 °C. Efter 30 minutters inkubation blev der derefter tilsat 6-CF eller 5-CF, som blev inkuberet i henholdsvis yderligere 5 og 10 minutter. Pladerne blev straks anbragt på isbad, og supernatanterne blev fjernet, hvorefter cellerne blev vasket tre gange med iskold PBS. Derefter blev der tilsat 100 μL 0,1 % Triton X-100 for at lyse cellerne, og fluorescensen blev målt med excitation ved 485 nm og emission ved 528 nm. Til kvantificering af proteinindholdet i hver brønd blev 10 μL cellelysat tilsat 200 μL fortyndet proteinanalysereagens (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.), og den optiske tæthed blev målt ved 570 nm. Den relative intracellulære ophobning af 6-CF eller 5-CF blev beregnet ved at sammenligne med kontrollernes ophobning efter proteinkorrektion.
Dataanalyse
Den maksimale serumkoncentration (Cmax) blev opnået ved eksperimentel observation. Arealet under serumkoncentrationen – tidskurven (AUC0-t) blev beregnet ved hjælp af trapezregelen til det sidste punkt. Forskellene i IS og PCS mellem tre grupper blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA, mens forskellen i Cr og BUN mellem to grupper blev analyseret ved hjælp af uparret Student’s t-test, idet p < 0,05 blev taget som signifikant niveau. Uparret Student’s t-test blev også anvendt til analyse af in vitro-analyser.