Funktionen af chaperonproteiner i sammensætningen af proteinkomplekser involveret i gametadhæsion og fusionsprocesser

Multiproteinkomplekser i spermkapacitation og ZP-interaktion

Når de når frem til befrugtningsstedet, ampullaen, skal spermatozoer gennemtrænge to barrierer, før de fusionerer med oocyttens plasmamembran eller oolema. Den første af disse er et hyaluronsyrerigt stratum af cumulusceller, der omgiver oocytten, og den anden er den ekstracellulære matrix af selve oocytten, ZP (Hartmann et al. 1972). På trods af udviklingen af både ZP- og hyaluronsyrebindingssteder under spermatogenesen og erhvervelse af bindingspotentiale, når spermatozoerne passerer epididymis, kræver disse celler en bestemt opholdsperiode i det kvindelige reproduktionstrakt, før de er i stand til med succes at deltage i sådanne interaktioner (Austin 1951, Chang 1951). De kollektive ændringer, som spermatozoerne gennemgår i dette miljø, kaldet kapacitation, sætter cellerne i stand til at reagere på signaler fra cumulus-ocytkomplekset og fuldføre en proces med akrosomal exocytose, hvilket gør dem kompetente til at fusionere med oolemaet.

ZP består af en række sulfoglykoproteiner, nemlig ZP1, ZP2 og ZP3, som er meget bevaret i de fleste pattedyrarter (selv om en yderligere ligand, ZP4/B, er blevet rapporteret i humane og svineoocytter) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Det er generelt opfattet, at disse ligander styrer sædbindingen hos de fleste arter (se også Reid et al. (2011)). Det er dog bemærkelsesværdigt, at der i øjeblikket stadig overvejes forskellige modeller med hensyn til identiteten af den primære sædreceptor i ZP og de mekanismer, hvormed sædcellerne hæfter sig til denne matrix (se også Visconti & Florman (2010))). Tilsvarende har undersøgelser af identiteten af den eller de tilsvarende receptorer på sædcellernes overflade, der genkender den eller de relevante ligand(er) på ZP, heller ikke givet nogen endegyldige svar. Faktisk er der en voksende litteratur om murine knockouts af lovende receptorproteinkandidater (herunder β-1,4-galactosyltransferase (GALT1), arylsulfatase A (ARSA) og spermadhæsionsmolekyle 1 (SPAM1); for en komplet liste, se Ikawa et al. (2010))), som hver især ikke resulterer i fuldstændig infertilitet (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Der er snarere tale om forskellige grader af reduceret bindingsevne, hvilket giver mulighed for, at denne proces omfatter en vis grad af funktionel redundans, og at en række sædproteiner handler i fællesskab for at formidle ZP-adhæsion. Koordineringen af disse proteiners aktivitet for at sikre produktive ZP-interaktioner er således ved at blive et vigtigt forskningsfokus.

I de fleste eutheriske pattedyr menes sædkapacitering at blive indledt ved aktivering af en cAMP-medieret vej, der kulminerer i tyrosinfosforylering af flere sædproteiner (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Molekylære chaperoner er fremtrædende blandt denne række af proteiner, idet HSP90AA1, HSP90B1 og HSPD1 er blandt de proteiner, der viser tyrosinfosforylering som følge af kapacitation (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). De nuværende modeller tyder på, at fosforyleringen af disse chaperoner under kapacitation udløser deres aktive rolle i samlingen af ZP-genkendelsesproteiner i komplekser og/eller translokationen af disse komplekser til overfladen af spermatozoer som forberedelse til befrugtning (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Ud over denne indirekte rolle i adhæsion af gameter har chaperoner på sædcellernes overflade også påståede funktioner som adhæsionsmolekyler, der formidler genkendelse af sulfoglycolipider under binding af gameter (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

For nylig er teknikken med blå native PAGE (BN-PAGE), som oprindeligt blev udviklet til analyse af elektrontransportkædens multienzymkomplekser (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), blevet tilpasset til vurdering af multimeriske sædoverfladekomplekser hos mus og mennesker (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Denne teknik giver mulighed for elektroforisk opløsning af native proteinkomplekser, der bevarer deres biologiske aktivitet. I menneskelige og muses spermatozoer har anvendelsen af BN-PAGE parallelt med Far-Western blotting med hele solubiliserede zonae afsløret flere primære multiproteinkomplekser, der har affinitet for homologe ZP (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Et sådant kompleks er blevet rapporteret at omfatte proteinkomponenterne i CCT/TRiC-komplekset (CCT1-CCT8), en dobbeltringstruktur, der fungerer som en molekylær chaperon med en nøglerolle i reguleringen af dannelsen af multiproteinkomplekser (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Putative beviser i form af co-immunoprecipitations-, co-lokaliserings- og proximitetsligeringsassays har identificeret ZP-bindingsprotein 2 (ZPBP2) som et af de mest overbevisende klientproteiner for CCT/TRiC-komplekset i modne spermatozoer (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Oprindeligt impliceret i sekundær ZP-binding, har en nyere undersøgelse vist, at hanmus, der er nul for ZPBP2, er subfertile og udviser defekter i ZP-interaktion og penetration (Lin et al. 2007). Hos mus er der yderligere beviser for, at visse CCT/TRiC-kompleksunderenheder transloceres til sædoverfladen under sædkapacitering (Dun et al. 2011).

En anden fremtrædende klasse af chaperoner, der er blevet identificeret på sædoverfladen og impliceret i reguleringen af ZP-interaktioner, er HSP70-familien (Naaby-Hansen et al. 2010). Som med CCT/TRiC-komplekset har chaperoner fra HSP70-familien også veldokumenterede roller i lempelsen af både transmembranproteintransport og samling af stabile proteinkomplekser (Mayer & Bukau 2005). Et medlem af HSP70-familien, der viser eksklusiv (mus) eller fremherskende (menneske) ekspression i testiklerne, synes at være afgørende for mandlig fertilitet. Faktisk er aberrant ekspression af dette chaperon, HSPA2, blevet korreleret med en fænotype af alvorlig mandlig infertilitet hos mennesker, der specifikt påvirker spermatozoernes evne til at interagere med homologe oocytter in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Hos både mus og mennesker spiller HSPA2 en grundlæggende rolle i spermatogenese, idet målrettet sletning af proteinet hos førstnævnte art fører til et tidligt stop i denne proces og en samtidig mangel på spermatozoer (Eddy 1999). Hos mennesker er ekspressionsniveauet af HSPA2 blevet positivt korreleret med succesen af befrugtning in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) og er derfor angiveligt i stand til at forudsige mænds frugtbarhedsstatus med en høj grad af nøjagtighed (Ergur et al. 2002).

Karakterisering af HSPA2 i vores eget laboratorium har afsløret, at dette chaperon er til stede i det akrosomale domæne af menneskelige sædceller og er en komponent i mindst fem proteinkomplekser med høj molekylmasse (Redgrove et al. 2012), herunder en undergruppe af dem, der tidligere er vist at besidde ZP-affinitet (Redgrove et al. 2011). I overensstemmelse med disse data har vi sikret os beviser for, at det mest dominerende af HSPA2-komplekserne indeholder to yderligere proteiner, som begge tidligere er blevet impliceret i sperm-zona-interaktioner (Redgrove et al. 2012). Endvidere har vi i overensstemmelse med de offentliggjorte resultater af Huszar et al. været i stand til at påvise en betydelig reduktion af HSPA2-niveauerne i spermatozoerne hos mænd med isolerede læsioner i deres evne til at indgå i interaktioner med ZP af homologe oocytter in vitro (Redgrove et al. 2012). Vores nuværende arbejde fokuserer på, om underskuddet i ZP-adhæsion enten skyldes aberrant dannelse af ZP-bindingssteder i de tidlige stadier af spermiogenese (Huszar et al. 2000) eller kan være resultatet af HSPA2’s manglende evne til at deltage i remodelleringsbegivenheder på sædoverfladen under kapacitering, såsom at lette samling og/eller præsentation af ZP-receptorer på sædoverfladen som forberedelse til ZP-interaktion.

I tillæg til vores eget arbejde med samling af sædoverfladekomplekser har Han et al. uafhængigt af hinanden identificeret et alternativt chaperonladet multiproteinkompleks på overfladen af musesædceller. Interessant nok, som dokumenteret ovenfor, er dette kompleks, der omfatter HSPA5, calnexin, integral membranprotein 2B og ADAM7, tilsyneladende samlet under kapacitation (Han et al. 2011). Mens funktionen af dette kompleks endnu ikke er fuldt ud belyst, er ekspressionen af ADAM7 blevet knyttet til tilstedeværelsen af yderligere ADAM-proteiner, ADAM2 og ADAM3 (Kim et al. 2006), som er vigtige for adhæsion af spermatozoer til ZP (Muro & Okabe 2011). Desuden er det kendt, at HSPA5 er involveret i fremme af adhæsion af sædceller af høj kvalitet til oviduktale epitelceller (OEC) i isthmus i det kvindelige reproduktionstrakt. Dannelsen af dette reservoir menes at have en overlevelsesfremmende effekt med hensyn til at opretholde sædceller i en ikke-aktiveret, hvilende tilstand som forberedelse til, at oocytten frigives til ampullen (Topfer-Petersen et al. 2002). Interessant nok er chaperonerne HSPD1 og HSPA5 også blevet lokaliseret til overfladen af bovin OEC og er således blevet impliceret i sæd-OEC-binding (Boilard et al. 2004).

Også i overensstemmelse med vores eget arbejde er det kompleks, der blev identificeret af Han et al. blev vist at opholde sig i membranmikrodomæner eller lipid rafts, specialiserede regioner af membranen, der udgør en platform for funktionel samling og præsentation af multiproteinkomplekser (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Partitioneringen af chaperonkomplekser i raftmiljøet er også blevet observeret for HSPA2 i menneskelige sædceller (Nixon et al. 2011) og for komponenter af CCT/TRiC-komplekset i musesædceller (Dun et al. 2011). Disse membrandomæner omfatter også en række yderligere formodede ZP-receptorproteiner, herunder GALT1, ZP3R og SPAM1, hvilket forstærker deres rolle i remodelleringen af sædoverfladen og i ZP-binding (Fig. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Den eller de mekanismer, hvormed sådanne proteiner rekrutteres til lipid rafts, er endnu ikke løst; HSPA2 er imidlertid blevet rapporteret til at binde via sit ATPase-domæne til 3′sulfogalactosylglycerolipid, det største glycoprotein, der er identificeret inden for sædets lipid rafts (Mamelak & Lingwood 2001).

Ud over den formodede rolle, som lipid rafts spiller ved omplacering af vigtige chaperonkomplekser og ZP-receptorproteiner, er der også overbevisende beviser for, at mange formodede ZP-receptorer, såsom ARSA og ZP3R, samt flere molekylære chaperoner viser en kapacitetsafhængig flytning fra intracellulære steder som f.eks. akrosomet til sædoverfladen for at forberede cellerne forud for deres interaktioner med ZP (Nixon et al. 2009). Det er blevet foreslået, at intim kontakt mellem den ydre akrosomale membran og sædcellernes plasmamembran formidles gennem binding af komplementære SNARE-proteiner (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), hvilket fører til dannelse af fusionsporer, der giver en vej til migration af enzymer til sædcellernes overflade før det fuldstændige tab af det akrosomale indhold (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). Til støtte for denne model viste en undersøgelse af Brahmaraju et al. (2004), at administration af antistoffer mod VAMP og SNAP i den akrosomale vesikel hæmmede sperm-ZP-binding i musen.

Denne progressive priming af sædoverfladen har rejst spørgsmål vedrørende den akrosomale exocytoses alt eller intet-natur. Ikke desto mindre synes den funktionelle samling af SNARE-komplekser også at understøtte de langvarige sædmembranfusionsbegivenheder, der tillader et fuldstændigt tab af det akrosomale indhold (Tsai et al. 2010). Selv om det er en udbredt opfattelse, at kontakt med ZP initierer denne akrosomale exocytose i de fleste pattedyrarter, har en række undersøgelser udført i musen vist, at sædceller, der påbegynder akrosomal exocytose før kontakt med ZP, stadig er i stand til at befrugte oocytten (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Dette fænomen kan også være gældende for marsvin (Huang et al. 1981) og hamster sædceller (Yanagimachi & Phillips 1984). Sådanne resultater tyder på en vigtig rolle for cumulus oophorus i initieringen af acrosomreaktionen og giver anledning til bekymring med hensyn til evnen af in vitro-undersøgelser, der er udført med cumulus-benægte oocytzonastrukturer, til nøjagtigt at rapportere om acrosomreaktionens sande karakter og faktisk ZP-interaktion.

Uanset denne kontrovers er chaperonlignende molekyler også blevet impliceret i akrosomal exocytose i kraft af deres evne til at fremme samlingen af glutaminholdige SNAREs (Q-SNAREs) og argininholdige SNARES (T-SNAREs) i tætte ternære komplekser (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Interessant nok har elegante undersøgelser hos svin vist, at kapacitation inducerer stabil docking af sædcellernes plasmamembran med den ydre acrosomale membran som forberedelse til befrugtning (Tsai et al. 2010). Nyere undersøgelser udført af Tsai et al. (2012) har også leveret beviser for tilstedeværelsen af unilamellære blandede vesikler, der blandt andre vigtige funktioner muliggør rekruttering af sekundære ZP-bindingsproteiner på sædets overflade og besidder et nyt trimerisk SNARE-kompleks bestående af syntaxin 3, SNAP23, VAMP2 og et yderligere protein, complexin 2. Den energi, der frigøres ved dannelsen af sådanne komplekser, bruges igen til at indlede membranfusion ved at trække plasmamembranen og den indre akrosomale membran i sædcellen sammen (Tomes et al. 2002). Gennemførelsen af denne proces er kritisk for eksponering af sædcellernes domæner, der deltager i de nedstrøms begivenheder i befrugtningen: oolemmabinding og fusion.