Oprindelige problemerRediger
TermolabilitetRediger
Den første anvendelse af FLP-FRT-rekombinase virkede ikke hos pattedyr. FLP-proteinet var termolabilt (denatureres ved forhøjede temperaturer) og var derfor ikke anvendeligt i pattedyrmodellen på grund af disse modelsystemers forhøjede kropstemperaturer. På grund af patenter og restriktioner for brugen af Cre-Lox-rekombination blev der imidlertid gjort en stor indsats for at fremstille en mere termostabil FLP-FRT-kassette. Nogle af de første resultater blev opnået af Buchholz et al. (1997) ved at anvende cyklende mutagenese i Escherichia coli . I deres forskning transfekterede forfatterne E. coli-celler med to plasmider: en, der kodede for tilfældigt muterede FLP-proteiner nedstrøms en arabinosepromotor, og en anden, der indeholdt en lacZ-genpromotor i en FRT-kassette. E. coli’erne blev dyrket på arabinoseplader ved 37 °C og 40 °C, og hvis der skete rekombination, ville lacZ-ekspressionen blive svækket, og kolonierne ville fremstå hvide. Hvide kolonier blev udvalgt fra hver generation og dyrket på en ny arabinoseplade ved de samme temperaturer som tidligere i otte generationer. Efter at rekombinationen var blevet bekræftet ved western-blotting, og de muterede FLP-gener var blevet sekventeret, blev denne ottende generation af FLP-protein (FLPe) transficeret til pattedyrcellekultur, og rekombinationen i pattedyrceller blev bekræftet. Denne variant af FLP har kun 4 aminosyresubstitutioner: P2S, L33S, Y108N og S294P.
Generering af genetisk mosaikRediger
Genetisk mosaik forekommer i en organisme, når ens celletyper udtrykker forskellige fænotyper på grund af forskellige genotyper på specifikke loci. Enkelt sagt sker det, når en organisme indeholder forskellige genotyper, hvilket normalt er sjældent i naturen. Dette kan dog let (og problematisk) frembringes ved hjælp af FLP-FRT-rekombination. Hvis der er to forskellige FRT-steder i en celle, og FLP er til stede i passende koncentrationer, vil FRT-kassetten fortsat blive udskåret og indsat mellem de to FRT-steder. Denne proces fortsætter, indtil FLP-proteinerne falder til under de krævede koncentrationer, hvilket resulterer i celler i en organisme med forskellige genotyper. Dette er set fra frugtfluer til mus, og det er ikke diskriminerende over for specifikke kromosomer (somatisk og køn) eller celletyper (somatisk og kimlinje).
Bestemmelse af cellelinjerRediger
Forud for publikationen af Dymecki et al. (1998) var Cre-rekombinase blevet anvendt til kortlægning af celletilfælde af neuronale progenitorer i mus ved hjælp af En2-promotoren. Forfatterne af Dymecki et al. (1998) teoretiserede således, at FLP-rekombinase kunne anvendes på en lignende måde med en lignende effektivitet som Cre-rekombinase i mus. Forfatterne skabte to transgene muselinjer: en neuronal Wnt1::Flp-fusionslinje og en linje, som besad FRT-kassetten, der flankerede det 18. exon af tm1Cwr. Forfatterne valgte dette exon til excision, fordi hvis det excideres, resulterer det i en nul-fænotype. Forfatterne parrede de to linjer og lod afkommet nå voksenalderen, inden afkommet blev ofret. RNA-ekstraktion blev udført på neuronalt, muskulært, enterisk og halevæv. PCR med omvendt transskription og northern blotting bekræftede, at tm1Cwr’s 18. exon blev afskåret i rigelig grad i hjernevævet og i moderat grad i muskelvævet (på grund af Scwhann-celler i musklen). Som forventet blev excision ikke set i andre væv. Forfatterne så lige så effektiv, hvis ikke bedre, effektivitet af FLP-rekombinase i celletilstandsbestemmelse end Cre-rekombinase.
I Drosophila melanogaster (Frugtflue)Rediger
Til dato er FLP-rekombinase blevet anvendt mange gange i D. melanogaster. En sammenligning af Flp-rekombinase med Cre-rekombinase i D. melanogaster blev offentliggjort af Frickenhaus et al. (2015). Forfatterne af Frickenhaus et al. (2015) havde et todelt mål: at karakterisere og sammenligne effektiviteten af Flp-rekombinase “knock-out” med Cre-rekombinase “knock-out” og RNAi-knockdown og afsløre funktionen af cabeza (caz), fluens ortolog til FUS, i neuroner og muskelvæv hos D. melanogaster. FUS er blevet stærkt impliceret i amyotrofisk lateralsklerose (ALS) og frontotemporal demens hos mennesker . Forfatterne brugte et elav-Gal4/UAS-Flp- eller Cre-system til at udtrykke rekombinasen specifikt i neuroner og et Mef2-Gal4/UAS-Flp- eller Cre-system til at udtrykke den specifikt i muskler. Forfatterne konkluderer, at Flp-rekombinase-“knock-out”-værktøjet er mere effektivt end både RNAi- og Cre-rekombinase med henblik på at slå specifikke gener ud i specifikke væv eller cellelinjer på grund af manglen på den utætte ekspression, der ses i både Cre-proteinet og RNAi-transkriptet. Forfatterne var også vidne til en toksicitet for Cre-proteinet, som ikke ses med Flp-proteinet.
I Danio rerio (Zebrafisk)Edit
Effektiviteten af FLPe-rekombinasesystemet blev evalueret i zebrafisk af Wong et al. (2009). Embryoner, der var hemizygote for et FRT-flankeret forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) nedstrøms en muskelspecifik promotor, blev injiceret med FLPe-proteinet. Uden FLPe skulle disse embryoner udtrykke EGFP i alt muskelvæv, og hvis de krydses med en vildtypestreng, skulle 50 % af de resulterende afkom også udtrykke EGFP i muskelvæv. Embryoner, der var injiceret med FLPe, havde signifikant reduceret ekspression af EGFP i muskelvæv, og der blev også set mosaikisme. Da disse embryoner nåede voksenalderen, blev de parret med en vildtypestamme, og de resulterende kuld havde betydeligt færre afkom, der udtrykte EGFP i muskelvævet (0-4 %). Disse resultater viser, at FLPe ikke blot er meget effektiv i somatiske celler, men også i zebrafiskens kimlinje,
I planterRediger
Oprettelse af “fytosensorer” eller “sentineller” i Arabidopsis thaliana og TobaccoRediger
Fytosensorer er genetisk modificerede planter, der kan rapportere om tilstedeværelsen af biotiske eller abiotiske forurenende stoffer. Det er indlysende, at produktionen af disse manipulerede planter er meget lovende for landbruget og laboratoriet. Det har imidlertid vist sig at være problematisk at skabe en passende reportervektor. cis-regulerende elementer spiller en vigtig rolle i den transkriptionelle aktivering af gener i planter, og mange af dem er ikke velforstået. Mange fytosensorer underudtrykker enten deres reportergener eller rapporterer falsk-positive resultater på grund af syntetiske promotorer. Forfatterne i Rao et al. (2010) benyttede FLP-rekombinaseværktøjet til fremstilling af en meget effektiv fytosensor. Forfatterne anvendte en heat shock-promotor til at inducere produktionen af FLP, mens en FRT-flankeret vektor adskilte CaMV 35S promotoren fra beta-glucuronidase-genet (GUS). Når planterne blev udsat for et hedeslag, førte FLP-induktion til udskillelse af den FRT-flankerede vektor, hvilket effektivt flyttede GUS-genet direkte nedstrøms fra CaMV 35S promotoren. Aktiveringen af GUS førte til, at planternes blade skiftede fra grøn til blå; således rapporterede fytosensoren effektivt stress til modelsystemet!
Med Cre-recombinaseRediger
Produktion af det gate-way-ready inducible MiRNA (GRIM)-ekspressionssystemRediger
RNA-interferens (RNAi) har forårsaget et paradigmeskift i ekspressionen af gener og potentielle genknockouts i Eukaryoter. Før fremstillingen af GRIM-ekspressionssystemet var det dyrt og tidskrævende at fremstille RNAi-vektorer. Vektorerne blev fremstillet ved hjælp af den traditionelle copy-and-paste-molekylær kloningsmetode. Garwick-Coppens et al. (2011) udviklede en langt mere effektiv metode til fremstilling af RNAi-vektorer, hvor ekspressionen af RNAi kan knockes ind ved hjælp af Cre-recombinase og knockes ud ved hjælp af Flp-recombinase. Det nye GRIM-ekspressionssystem gør det muligt at generere ekspressionsvektorer, der indeholder kunstige RNAi-konstruktioner, meget hurtigere. Forfatterne viste endvidere, at deres ekspressionssystem fungerer ganske effektivt i humane embryonale nyrer (HEK-celler), som er en almindelig human immortaliseret cellelinje inden for molekylær forskning.