FFPE-prøver – Forberedelse af humane vævsprøver – Lab-Ally

Indholdsfortegnelse

Indledning |Indsamling af væv |FFPE-vævsbehandling |Sektionering | Referencer

Hvis du har brug for FFPE-prøver eller andre humane bioprøver til din forskning, bedes du kontakte os.

Indledning

Mange af nutidens forskere foretrækker at bruge FFPE-prøver af væv til deres IHC, histologiske eller in-situ genomiske analyser. FFPE står for “Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” og beskriver de to hovedtræk ved denne metode til vævskonservering. Formalin er en formaldehydopløsning og har været anvendt siden den tyske læge Ferdinand Blum i slutningen af 1800-tallet opdagede den konserverende virkning af formaldehyd (Fox, et al., 1985). Paraffin indlægges i vævet efter fiksering med formaldehyd, og vævet er også omgivet af et paraffinhylster for at støtte det og beskytte det mod oxidation. Professionelt fikserede og indlejrede FFPE-prøver og de biomolekyler, de indeholder, er rimeligt stabile ved omgivelsestemperaturer. Strukturelt er de fikserede og indlejrede væv elastiske og kan anvendes til mikroskopiske anatomiske undersøgelser næsten på ubestemt tid, men med tiden vil nogle proteiners antigenicitet blive nedbrudt, hvilket begrænser IHC-undersøgelser til prøver, der ikke er ældre end et par årtier. Dobbeltstrenget DNA er overraskende stabilt i FFPE-blokke, men andre mindre stabile biomolekyler såsom RNA kan nedbrydes inden for et årti eller mindre, især når sektioner er blevet skåret.

Arkivalier, der akkumulerer et stort antal FFPE-prøver, er en særlig rig kilde til data, når sammenligning af mange tilfælde (dvs. FFPE-prøver fra flere donorer) er ønskelig med henblik på at drage statistisk robuste konklusioner om karakteristika for bestemte indikationer. Hvis FFPE-prøverne skal anvendes i biomedicinsk forskning med “store indsatser”, er det vigtigt, at alle faser af forberedelsesprocessen udføres af fuldt uddannede og certificerede fagfolk, helst i et CLIA-certificeret (dvs. statsinspiceret) eller CAP-akkrediteret (College of American Pathologists) laboratorium.

Det skal bemærkes, at FFPE-processen ikke er universelt standardiseret, og institutioner over hele verden kan anvende lidt forskellige protokoller med forskellige formalinopløsninger eller på anden måde skræddersy processen efter deres præferencer og krav. Det følgende er en oversigt over processen og beskrivelser af, hvad hvert trin indebærer, samt nogle almindelige variationer.

Vævsindsamling

Forud for vævsbehandlingen er det nødvendige trin vævsindsamling. Dette er faktisk det vanskeligste element at kontrollere, fordi det er sammenflettet med patientpleje, 41CFR46-overholdelse og i USA tilsynet med IRB (Internal Review Board). Den medicinske procedure og konventionerne for standardbehandling er vigtige, fordi de kan påvirke variabler som f.eks. tidsintervaller mellem indgivelse af anæstesi og ligering af kar, fjernelse af vævet og den tid, der går inden fiksering, hvilket alt sammen kan påvirke prøvens kvalitet. F.eks. vil der sandsynligvis ske ændringer i RNA og proteiner i tidsintervallet, kendt som varm iskæmi, mellem ligering af blodforsyningen og fjernelse af vævet (Dash, et al., 2002). Denne ischemitid kan variere fra minutter til timer afhængigt af organet, institutionens standardoperationsprocedurer, kirurgen og det øvrige involverede sundhedspersonale samt den kirurgiske fremgangsmåde. Derfor er det blevet anbefalet, at denne tid registreres for hver enkelt prøve, og at den holdes på et minimum (Hewitt, et al., 2008).

FFPE-vævsbehandling

Når vævsprøven er blevet erhvervet, kan der være behov for yderligere triage, dissektion eller mikrodissektion (samlet benævnt grossing) for at isolere og forberede den specifikke del af vævet, der skal gennemgå de resterende behandlingstrin. Vævsbehandling er i dag ofte fuldstændig automatiseret indtil det sidste trin, indlejring, som kan udføres manuelt. Der findes mange vævsbehandlingsmaskiner, men alle følger de første fire trin i den ovenfor viste rækkefølge. Automatiseringen af de forskellige trin bidrager til at eliminere variationer i proceduren som kilde til variation i de eksperimentelle resultater mellem forskellige FFPE-prøver.

Fixering

Fixering er det første trin i FFPE-vævsbehandlingen. Kritiske faktorer, der skal tages i betragtning, omfatter den opløsning, der skal anvendes, den tid, der gives til fiksering, og tykkelsen og de histologiske egenskaber af den vævsprøve, der skal fikseres.

– Opløsning

Det fikseringsmiddel, der anvendes af de fleste laboratorier, er neutralt bufferet, 10% formalin. Formalin er en væske, der består af 37-40 % formaldehyd og 10 % methanol (efter vægt) i vand; en 10 % formalinopløsning indeholder således ca. 3,7 % – 4 % formaldehyd og 1 % methanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). I virkeligheden findes formaldehyd i opløsning primært som monomerer eller små polymerer af methylenglycol (methandiol, formaldehydmonohydrat), som dannes ved den reversible reaktion af formaldehyd med vand. Polymerer af methylenglycol med høj vægt betegnes paraformaldehyd og udfældes i opløsningen, men methanol bremser denne polymerisationsproces, hvilket er grunden til, at methanol indgår i formalinopløsninger. Formalin fortyndet med vand (f.eks. 10 % formalin) – og især hvis det er en bufferopløsning – vil hovedsageligt indeholde monomerer, da det store antal vandmolekyler opløser eventuelle methylenglycolpolymerer, der normalt ville have eksisteret i en opløsning med en højere formaldehydkoncentration (Kiernan, 2000). Buffere, som er den resterende bestanddel af formalin, tilsættes også, fordi formaldehyd har en tendens til at oxidere til myresyre (Fox, et al., 1985). Myresyre i vævsfiksering kan resultere i udfældning af formalinpigmentgranulat (syrehematin), som kan ligne pigmenter, der produceres af visse parasitter (Pizzolato, 1976). Buffering af formalin forhindrer, at dette sker. Almindelige buffermidler omfatter magnesiumcarbonat, calciumcarbonat, citrat, Tris og fosfatbuffere (Hewitt, et. al., 2008). Kommercielt formalin indeholder ofte fosfatbuffere. “Neutralbufferet”, som typisk er den måde, hvorpå formalin fremstilles, betyder blot, at pH-værdien holdes på omkring 7.

– Proces og mekanisme

På grund af de lave molekylvægte af formaldehyd og methylenglycol trænger formalin (primært methylenglycol i opløsning) relativt hurtigt ind i væv, med en hastighed, der afhænger af vævstypen, men med en gennemsnitlig hastighed på 1 mm/time (Hewitt, et al., 2008). Protokollerne for fiksering vil derfor variere afhængigt af, hvilken type væv der skal fikseres. Når først den del af formaldehydmolekylerne, der er i opløsningen, er inde i vævet, vil de begynde at krydsbinde sig med proteinerne, men dette sker med en meget langsommere hastighed end diffusionshastigheden. Formaldehydets reaktion med vævet trækker det ud af opløsningen og trækker den reversible reaktion fra formaldehyd til methylenglycol tilbage i formaldehydets retning, således at der produceres mere af det, selv om det forbruges (Fox, et al., 1985). Lysinaminosidekæderne er de mest reaktive med formaldehyd, men andre, der er noget reaktive med formaldehyd, omfatter argininin, asparagin, histidin, glutamin, serin og tyrosin (Howat og Wilson, 2014). Efter reaktionen kan den resulterende hydroxymethylgruppe, der er knyttet til komplekset, derefter reagere yderligere med det samme protein eller andre proteiner, hvorved der dannes stabile methylenbroer (protein-CH2-protein) (Kiernan, 2000). Det er dette, der skaber uopløseligheden og stivheden i væv, der er blevet formalinfikseret og dermed konserveret. Der kræves ca. 24-48 timer for at denne tværbinding kan ske tilstrækkeligt i hele vævet (Thavarajah, et al., 2012), men det er blevet anbefalet, at der ikke gives mere end 36 timer til denne proces, da fiksering i en længere periode vil forringe kvaliteten af biomolekyler i FFPE-prøverne, f.eks. ved at forkorte længden af nukleinsyrer, der kan ekstraheres (Hewitt, et al, 2008).

– Begrænsninger

Den største fordel ved at bruge formaldehyd – især som neutralt bufferet, 10 % formalin – er, at det bevarer en bred vifte af væv og komponenter. Det har dog også begrænsninger. For eksempel anvendes en kombination af formaldehyd med glutaraldehyd (C5H8O2) eller en opløsning af glutaraldehyd alene typisk til elektronmikroskopi (Kiernan, 2000), da disse opløsninger er bedre til at bevare vævsstrukturer til dette formål. Bemærk, at væv præpareret med en glutaraldehyd- eller glutaraldehyd-aldehydopløsning ikke vil blive betragtet som FFPE-prøver. En anden udfordring er udtagning af DNA- og RNA-molekyler fra FFPE-væv, da formalin har en tendens til at modificere nukleinsyrer – selv i en sådan grad, at der indføres kunstige mutationer i DNA – og bryde dem op i små fragmenter (Srinivasan, Sedmak og Jewell, 2002). Alligevel er det muligt at udtrække DNA- og RNA-fragmenter fra FFPE-væv, der er egnede til analyse, som beskrevet i en protokol skrevet af Tang, et al. (2009), hvor en nøglefaktor i nukleinsyregenvinding er en passende proteasefordøjelse. Der findes også kommercielle kits til ekstraktion af nukleinsyre fra FFPE-prøver.

– Prøvens tykkelse

Et andet vigtigt punkt, der skal overvejes med hensyn til formalinfiksering, er vævsprøvens tykkelse. Formalin trænger som nævnt ovenfor relativt hurtigt ind i vævet, men vævets tykkelse vil som nævnt ovenfor påvirke kvaliteten af den fikserede prøve. Det vil kræve mere tid for formalin at nå ind i midten af tykkere vævsprøver. Mens formalin gradvist diffunderer ind i de inderste dele af prøven, vil de yderste områder allerede have påbegyndt fikseringsprocessen, således at biomolekylerne der er mere tilbøjelige til at blive nedbrudt i løbet af den langvarige tid, der er nødvendig for en fuldstændig fiksering. Hvis tidsgrænserne overholdes (f.eks. højst 36 timer som nævnt ovenfor), er der desuden mulighed for, at vævsprøven ikke vil blive tilstrækkeligt fikseret (bevaret) i sin helhed. Derfor bør væv til fiksering, der er bredere end flere millimeter eller måske en eller to centimeter, med fordel dissekeres i tyndere segmenter for at opnå en optimal fiksering (Hewitt, et al., 2008). Institutioner kan have forskellige protokoller for den tidslængde og mængde fixeringsmiddel, der kræves for vævsprøver af forskellig bredde, men generelt bør forholdet mellem mængden af fixeringsmiddel og mængden af væv være 10:1 (Klatt, 2016).

Dehydrering

Det andet trin i behandlingen af FFPE-prøver er dehydrering. Da paraffin ikke er umiskelig med vand, skal alt vand fra formalinopløsningen fjernes fra vævet, før paraffin kan infiltrere det. Der anvendes en række alkoholopløsninger (ofte ethanol), ofte begyndende med 70 % og fortsættende til 100 % alkohol, for at fjerne stort set alt vand fra vævet. For at opnå en optimal dehydrering er det nødvendigt at anvende nye opløsninger eller hyppigt udskifte brugte opløsninger, da alkoholen fortyndes mere og mere efter brug. Det er også bydende nødvendigt, at dette trin gennemføres fuldt ud (med tilstrækkelig tid afsat til dette trin), da utilstrækkelig dehydrering kan føre til nedbrydning af vævet (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Afrensning

Da paraffin faktisk heller ikke er blandbar med alkoholer, er det næste trin at fjerne alkoholen med et stof, der er blandbart med paraffin. Dette trin kaldes clearing, og xylen er det clearingmiddel, der oftest anvendes (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Paraffininfiltrering

Efter passende fiksering, dehydrering og clearing kan vævet til sidst gennemgå paraffinininfiltrering (eller imprægnering). Dette trin er heller ikke standardiseret, og institutioner fra hele verden kan anvende forskellige paraffiner og voksblandinger af varierende sammensætning. Paraffiner har forskellige smeltepunkter og teksturer, som påvirker den endelige vævsblok og dens egenskaber. I USA og i Vesteuropa anvendes der normalt syntetiske paraffiner med lavt smeltepunkt (55 °C-63 °C) for at opnå de bedste resultater. Latex, dimethylsulfoxid og proprietære “blødgøringsmidler” kan indgå i formuleringen for at ændre den endelige vævsprøves tekstur og formbarhed (Hewitt, et al., 2008).

Nationer fra andre dele af verden vil ofte inkorporere bivoks i deres formuleringer for at forbedre formbarheden og sænke smeltetemperaturen for de anvendte paraffiner af lav kvalitet. Bivoks indeholder imidlertid forurenende stoffer som f.eks. pollen, og det forringer kvaliteten af den endelige prøve. Højere smeltetemperaturer skal undgås, fordi de senere resulterer i nedsat og utilstrækkelig deparaffinering af vævsprøven samt et fald i mængden af nukleinsyrer, der genvindes fra vævet (Hewitt, et al., 2008).

Paraffinindlejring

Det sidste trin i behandlingen af FFPE-prøver er paraffinindlejring. Den vævsprøve, der er infiltreret med paraffin, er omgivet af et lag paraffin. Man skal være omhyggelig med at orientere vævsblokken korrekt i formen (“kassetten”), da dette har indflydelse på snitplanet, når tynde snit skæres af blokken med et mikrotom (Klatt, 2016). Når paraffinkappen er størknet, er FFPE-blokken klar til opbevaring og vil forblive velbevaret i årevis, endda op til årtier (Hewitt, et al., 2008).

Snitning

Når vævet er indlejret, er det klar til at blive snittet på mikrotomet. Da vævet ikke altid er helt fladt mod fronten af paraffinen, skal histoteknikeren typisk “vende” ind i blokken. Vævsblokken sættes i mikrotomets blokholder, og mens han justerer blokholderens vinkel, så der spildes så lidt væv som muligt, drejer histoteknologen på håndhjulet og bevæger blokken op og ned mod en skarp klinge. Blokken skæres, indtil et fuldt repræsentativt udsnit af vævet befinder sig forrest på blokken. Når vævet er foran, lægges blokken på is for at afkøle, hvilket vil gøre det lettere at skære tynde snit; for varmt paraffin vil skabe komprimeret væv med rynkede snit. Når blokken er afkølet, lægges den tilbage i blokholderen. Teknikeren drejer igen på håndhjulet, denne gang i et langsomt, jævnt tempo for at skabe fortløbende tynde sektioner, der klæber til hinanden og danner et “bånd”.” Båndet lægges i et varmt vandbad (temperaturen holdes lige under paraffinens smeltepunkt) for at udglatte eventuelle rynker, der har dannet sig. Teknikeren placerer derefter et objektglas i vandbadet og “skovler” det eller de valgte afsnit op, så de klæber til objektglasset.

Den mest almindelige tykkelse for vævssnit er mellem 3-5 mikrometer (eller forkortet mikron), hvilket svarer til tykkelsen af en enkelt celle. Objektglas med 3-5 mikron sektioner anvendes normalt til farvning, hvad enten det er standardfarvning med hæmatoxylin & Eosin (H&E), specialfarvning eller immunohistokemisk (IHC) farvning. Forskere vil ofte anmode om “krøller” i stedet for tynde snit på objektglas. Krøller er tykkere sektioner (10 mikron eller mere), der lægges i Eppendorf-rør, og de anvendes generelt, når der skal ekstraheres RNA eller DNA fra FFPE-prøverne. Tykke sektioner kan også anbringes på objektglas i stedet for på rør; dette er optimalt, når kun en del af vævet skal bruges til ekstraktion. I dette tilfælde skrabes vævet af objektglasset og lægges i et rør. FFPE-prøver, der er blevet snittet, er strukturelt stabile, og hvis de behandles og opbevares korrekt, kan de anvendes til mikroskopisk analyse i nogen tid efter snittet, men hvis der skal foretages kemiske ekstraktioner, bør snittene generelt anvendes så hurtigt som muligt efter snittet for at forhindre oxidativ og biologisk nedbrydning af de eksponerede målmolekyler.

Søger du oplysninger om histologi og fremskaffelse af FFPE-blokke, der repræsenterer specifikke indikationer? Se vores side med histologiske ressourcer. Lab-Ally er førende i branchen inden for overholdelse af 45CFR46 og 21CFR11, etisk fremskaffede humane biospecimens, bioinformatik, videnskabelig datastyring og meget mere.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehydfiksering. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Ændringer i differentiel genekspression på grund af varm iskæmietid af radikale prostatektomiprøver. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Håndtering af væv og præparering af prøver i kirurgisk patologi: Problemer vedrørende genvinding af nukleinsyrer fra formalinfikseret, paraffinindlejret væv. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehyd, formalin, paraformaldehyd og glutaraldehyd: Hvad de er, og hvad de gør. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Hentet fra http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Formalinpigment (syrehematin) og beslægtede pigmenter. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Vævsfiksering og virkningen af molekylære fixeringsmidler på efterfølgende farvningsprocedurer. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Kemiske og fysiske grundprincipper for rutinemæssig formaldehydfiksering. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Virkning af fiksationsmidler og vævsbehandling på indholdet og integriteten af nukleinsyrer. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). DNA-udtrækning fra formalinfikseret, paraffinindlejret væv. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Hentet fra http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Tilgået 28. dec. 2016